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T-DNA插入突变技术是产生突变体的常用方法,近些年来,T-DNA插入突变技术在拟南芥、烟草、水稻、大麦等植物突变体的获得中得到了广泛的应用。本研究使用T-DNA插入突变的方法对三生烟草进行叶盘法转化,产生20个突变品系,命名为121-1,121-2,121-3,121-4......121-20。并用烟草花叶病毒(TMV)和软腐病菌(Ecc)分别接种,进行抗病筛选,筛选到一个抗病品系(121-3),定名为121-3突变体。通过单株收种法,获得了121-3突变体的纯合植株。从生长上观察,121-3突变体与野生型(WT)没有差异。而接种TMV后,121-3突变体的病斑数和病斑面积明显都比野生型的少,抗病性提高。抗病防卫相关基因检测显示在121-3突变体中PR-1a基因的表达显著增强；接种Ecc后,121-3突变体发病明显要比野生型发病轻,抗病性提高；但接种黑胫病菌后,抗病性却不如野生型。所以T-DNA插入引起了与抗病相关基因的改变,而没有影响与生长相关基因的改变。并通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)即热不对称交错PCR得到T-DNA右边界侧翼植物DNA序列(281bp),从而初步鉴定了T-DNA插入位置。通过TAIL-PCR得到的T-DNA右边界侧翼植物DNA序列(281bp),经RT-PCR检测,此段植物序列在121-3突变体中被激活表达,我们把这段植物序列命名为NtTIA。 NtTIA在121-3突变体中根、茎、叶、花、叶柄中都能转录表达,但在野生型(WT)的各个部位都没有转录表达,所以T-DNA插入引起NtTIA在121-3突变体中组成性转录表达。NtTIA能够被TMV、Ecc诱导增强转录表达,NtTIA可能与抗病性有关。我们还使用生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)处理WT和121-3突变体,发现NtTIA在WT中还是没有转录表达,而在121-3突变体中,水杨酸处理可诱导NtTIA的表达减弱,茉莉酸的处理可诱导NtTIA的表达增强,说明NtTIA可能参与水杨酸和茉莉酸信号传导的通路中的抗病防卫机制。此外,我们利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(RACE, rapid amplification of cDNA ends)方法扩增出NtTIA的3’端和5’端的表达序列,结果发现其3’端是烟草植物序列,而5’端则是pBⅡ21载体上的序列,与T-DNA插入原理一致,所以想获得NtTIA的全长序列还有待于进一步研究T-DNA的左边界。核黄素(VB2)是一种多功能性的维生素,对动植物、微生物的生长、抗病都有很重要的作用。催化核黄素合成的倒数第二步的关键因子2,4-二氧四氢喋啶合酶(LS)对生物体内的核黄素的含量起着重要的调控作用。为了深入解析LS对植物的生物学效应,我们从水稻上克隆OsLS基因,并将OsLS基因转入烟草(三生烟),获得了异源表达OsLS的转基因烟草(LSETT)。OsLS转基因烟草的产生是由本实验室的吴廷全博士完成。接下来,从分子水平上鉴定了转基因的成功。通过southern blot分析发现,OsLS转基因株系1是双拷贝插入。表达OsLS的转基因烟草(LSETT)与野生型(WT)相比,对烟草花叶病毒病(tobacco mosaic virus, TMV)的抗性增强。抗病防卫相关基因NPR1、PR-1a、PR-1b、GST1的检测结果显示在转基因烟草(LSETT)中,NPR1、PR-1a、PR-1b、GST1的表达显著增强。本硕士论文包含的部分研究内容是与本实验室吴廷全博士共同协作完成的,为了体现论文的完整性,经导师同意,协作工作内容也列入本论文。