质粒型超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)和染色体头孢菌素酶(AmpC)是肠杆菌科细菌对新的广谱头孢菌素、氨曲南等耐药的重要原因。近年的研究显示，AmpC酶可以与ESBLs同时存在于同一个质粒上，携带此质粒的菌株对除碳青霉烯类以外的所有β-内酰胺类耐药，这样的质粒若在菌株之间传播，将会对临床治疗和院内感染控制造成极大的困难。对于ESBLs的具体型别，世界各地研究报告有所差异，而中国临床分离的大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌主要产CTX-M型ESBLs对于质粒AmpC酶的型别，世界各地研究报告大致相同，主要为DHA-1型AmpC酶，其次为CMY-2型。为了解华山医院2005年临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs和质粒AmpC酶的基因型，我们进行了以下3个方面的研究。 第一部分一种简单的同时鉴定和检测产超广谱β内酰胺酶细菌的方法 目前，在临床微生物实验室中，通常采用CLSI推荐的酶抑制剂增强试验检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌中的ESBLs检测ESBLs时，常选用头孢噻肟和头孢他啶两种第三代头孢菌素作为筛选ESBLs的底物。但据国内外文献报道，在中国，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌所产的ESBLs大多数为CTX．型ESBLs,此酶对头孢噻肟的水解能力特别强。 CHROMagar 是一种专用于鉴定尿道感染病原菌的产色琼脂，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分别在上面产生粉红色和湿润铁蓝色菌落。其原理是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在生长代谢过程中产生酶与培养基中的显色底物发生反应而变色。在本研究中，我们通过采用这种能特异性鉴定大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的CHROMagar产色琼脂，并结合64μg/mL，的头孢噻肟，建立一种能同时达到鉴定细菌并检测鉴定菌产生ESBLs功能的简易方法，供临床微生物实验室应用。建立的简易方法并和CLSI推荐的ESBLs确认方法一酶抑制剂增强试验进行比较。 结果显示，采用CLSI推荐的酶抑制剂增强试验确认检测260株大肠埃希菌中，ESBLs的检出率为67.3％(175/260)，肺炎克雷伯菌中ESBLs的检出率为69.7％ (200/287)。CHROMagar产色琼脂结合64μg/mL头孢噻肟对上述细菌中的ESBLs的检出率分别为66.1％(172/260)和68.6％(197/287)。两种方法产ESBLs菌株检出符合率为99.6％，灵敏度为98.3％～98.5％，特异性为100％。含64μg/mL头孢噻肟的CHROMagar产色琼脂可以同时用于菌种鉴定和产ESBLs菌株的检测。 第二部分疑似产ESBLs但头孢吡肟敏感的大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌中ESBLs和质粒AmpC酶的研究 在运用CLSI推荐的酶抑制剂增强试验检测临床分离的大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌中产ESBLs菌株时，往往会遇到细菌对头孢噻肟和/或头孢他啶耐药，但头孢噻肟/克拉维酸和/或头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈直径分别与上述单药的抑菌圈直径之差<5mm，无法判断这些菌株产生ESBLs的属性。推测上述细菌可能同时产生ESBLs和AmpC酶。由于AmpC酶的活性不能被克拉维酸所抑制，其产生的耐药表型覆盖了ESBLs产生的耐药表型。因此可导致ESBLs检测出现假阴性结果。我们对2005年上海华山医院临床分离的20株疑似产ESBLs但头孢吡肟敏感的大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌进行了ESBLs和质粒AmpC酶的研究。 结果显示，20株疑似产ESBLs但头孢吡肟敏感的大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌主要产生质粒介导的AmpC酶。7株克雷伯菌属细菌有6株产DHA-1型AmpC酶，13株大肠埃希菌中有10株产CMY-2型.AmpC酶。2株产DHA-1型AmpC酶的肺炎克雷伯菌中还分别伴随产生SHV-62型和CTX-M-14型ESBL。编码ESBLs和DHA或CMY型质粒AmpC酶的基因可随同质粒的转移接合转移至敏感细胞中。PFGE结果显示，6株肺炎克雷伯菌的谱型均不相同；而11株大肠埃希菌中有7株谱型完全一致，7株谱型完全一致的菌株中有5株来源于同一病房(6病房)，另外2株分别来自27病房和门诊病人。这7株细菌中除一株分离时间较早外(2005年3月)，其余6株在1个半月内分离到(2005年11月～2005年12月)，所有7株细菌均产生CMY-2型质粒介导的AmpC酶，提示存在克隆菌株爆发流行的可能。 第三部分一株同时产CTX-M-14型ESBL、DHA-1型质粒AmpC酶、qnrB-4和qnrS-1基因的肺炎克雷伯菌的研究 上述第二部分的研究中发现20株大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌的药敏试验结果显示：有16株细菌同时对头孢噻肟和喹诺酮类等抗菌药物耐药。因此我们采用PCR技术对上述菌株进行质粒介导喹诺酮类药物耐药基因qnr基因进行检测，并同时采用质粒转移接合试验、Southern杂交、PCR 等分子生物学技术对CTX-M-14型ESBL、DHA-1型质粒AmpC酶和qnr 等耐药基因进行了基因定位研究。 PCR检测qnr 基因结果显示，7株克雷伯菌属细菌中有6株qnrB基因检测阳性，其中一株肺炎克雷伯菌(菌种号为05-2250)同时检出qnrS基因。而13株大肠埃希菌中无一株检出qnr 基因。 PCR检测结果显示05-2250肺炎克雷伯菌同时含有以下4种基因：qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因。质粒转移接合试验获得含单qnrB基因接合子以及同时含qnrB和qnrS基因接合子；通过电转化试验获得单含qnrS基因接合子。环丙沙星Etest结果显示供体菌05-2250肺炎克雷伯菌、单含qnrB接合子、单含qnrS接合子、同时含qnrB和qnrS接合子以及接合子E.coli J53的MIC分别为0.75μg/mL、0.094μg/mL、0.38μg/mL、0.25μg/mL、0.012μg/mL。接合子的环丙沙星MIC是受体菌E.coli J53环丙沙星MIC的8～32倍。质粒抽提结果显示05-2250肺炎克雷伯菌共有4条质粒DNA条带，质粒大小依次为180kb、40kb、6kb、4kb。以质粒DNA为模板，PCR检测qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因结果显示qnrB、CTX-M-14和DHA-1基因位于同一大小约为180kb的质粒上，而qnrS则单独位于大小约为40kb的质粒上。Southern杂交试验也证实qnrB基因位于大小约为180kb的质粒上，而qnrS则单独位于大小约为40kb的质粒上。