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基因组编辑技术在研究动植物基因功能和应用中有着非常重要的作用。最近,CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术的发现,尤其是CRISPR的第二类B型即CRISPR/Cas9得到了快速发展。Cas9在一个约20个碱基大小的RNA引导之下,去切割与该RNA互补的DNA双链,形成DNA双链断裂(Double Strand Break)。在体内,由NHEJ和HDR来修复DSB,并引入一些碱基的插入或缺失突变,进而引起移码突变致使基因功能沉默。和ZFNs(zinc finger nuclease)、TALENs(transcriptional activate like-effector nuclease)相比,CRISPR/Cas9系统不仅节约时间、更加高效而且还便于操作,因此该技术在模式植物和作物中得到了广泛应用。本论文中进行了以下几方面的研究。(1)本文根据植物体内密码子编码偏好性,对SpCas9进行密码子优化,提高了其GC含量,约占49%,使其能够在植物体内稳定表达。将优化后的Cas9与sgRNA整合到一个载体上,选择小麦的TaAGO4a进行验证其功能。通过转化小麦原生质体,通过XmnI酶切和测序比对,我们检测发现发生突变缺失-6bp到插入+84bp,突变效率约为7.00%。转化春小麦CB037,获得36株阳性植株,检测到1株发生突变,缺失-7bp,突变效率约为2.78%。(2)为了扩大CRISPR/Cas9技术的使用范围,我们对PAM位点进行了改造。传统的CRISPR/Cas9由于受到PAM:NGG位点的约束,限制了其使用范围。同时在小麦全基因组CDS区间,PAM:NGA的数量比PAM:NGG的位点多约24.78%;在水稻中,PAM:NGA的数量比NGG的位点多约12.34%。因此通过改造Cas9,使其能够识别NGA,将会增加其使用范围。我们通过PCR定点突变技术,将传统的Cas9基因序列进行突变,改变编码氨基酸。由1135位的天冬氨酸(D)突变缬氨酸(V),由1335位的精氨酸突(R)变为谷胱氨酸(Q),由1337位的苏氨酸(T)突变为精氨酸(R),命名为Cas9-VQR。以水稻OsPDS(八氢番茄红素脱氢酶)为候选基因进行验证,通过体外酶切活性检测和转化水稻植株两种方法,均证明改造后的Cas9-VQR可以有效的切割基因靶位点。体外活性检测中其切割效率为5%-70%,水稻体内切割效率约为27.50%-70.50%,平均切割效率为46.23%。(3)我们对CRISPR/Cpf1技术进行了改造和初步尝试。与CRISPR/Cas9相比,CRISPR/Cpf1识别位点为PAM:TTN,其切割目的位点后产生粘性末端,同时CRISPR/Cpf1的sgRNA较短,在体内更容易结合。因此,我们对Cpf1进行密码子优化,构建CRISPR/Cpf1植物表达载体,以水稻OsPDS为候选基因进行功能验证。通过转化水稻植株,我们发现后代出现植株白化现象和白绿相间表型,通过测序没有检测到目的位点突变。利用qPCR技术检测Os PDS的表达,发现其表达量发生不同程度的降低。因此,我们推测我们构建的CRISPR/Cpf1系统可能在sgRNA的引导之下结合在目的基因位点,阻碍该基因的转录,而没有发生切割。综上所述,我们对CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1技术进行了一定的改造,并在水稻和小麦中进行了验证。我们的工作证明我们扩展了CRISPR技术的应用范围,同时有可能有助于农作物的育种和品种改良。