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实验目的通过观察蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin,MENK）对体外人鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用以及对体内荷CNE2瘤裸鼠的肿瘤形成时间、大小、生存率的影响,分析其结果,进而对可能的机制进行rescue验证,探讨MENK对人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的抑制作用及其可能的作用机制,继而为鼻咽癌的治疗提供新的思路。实验方法一、MENK在体内及体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的实验研究1、MENK体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的实验研究体外培养人鼻咽癌CNE2细胞,分为阴性对照组（Ctrl组）和MENK组,通过MTT法检测MENK对CNE2细胞增殖的抑制程度,计算MENK对CNE2细胞的生长抑制率;利用显微镜记录MENK对CNE2细胞形态的影响;通过流式细胞分析技术检测两组间CNE2细胞的细胞周期和凋亡率有无差异;通过qRT-PCR检测CNE2细胞阿片受体的表达情况以及MENK对其表达有无影响;增加阿片受体NTX拮抗组,通过细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检测三组间CNE2细胞迁移、侵袭转移能力的差异情况;2、MENK体内对荷CNE2瘤裸鼠抗肿瘤作用的实验研究采用BABL/C Nude裸鼠30只,皮下注射CNE2细胞悬液制作荷CNE2瘤裸鼠模型。分设3组,即Ctrl组、MENK组及NTX组,其中Ctrl组给予注射生理盐水、MENK 组给予 50mg/kgMENK,NTX 组给予 NTX10mg/kg 0.5h 后再给 50mg/kg MENK,每日观察裸鼠状态及皮下CNE2瘤的生长情况,定期记录肿瘤体积变化,于第42天处死裸鼠,取瘤,称重、测量瘤体大小,对比三组间有无差异及其意义;通过HE染色及免疫组织化学染色方法查看肿瘤组织病理形态的差异,从而分析MENK对CNE2瘤生长的抑制作用及其可能途径。二、蛋氨酸脑啡肽（MENK）抑制人鼻咽癌CNE2细胞迁移侵袭机理的实验研究通过WesternBlot检测MENK作用前后CNE2细胞中侵袭迁移相关蛋白的表达变化情况,推测MENK可能的作用途径;然后通过OGFr-siRNA瞬时下调OGFr的表达以及TGF-β/smad通路拮抗剂SB431542的应用干预CNE2细胞,再观察MENK对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制作用的改变情况;并通过免疫荧光分析β-catenin的降低在MENK对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制作用中的意义,进而深入探讨MENK抑制人鼻咽癌CNE2细胞侵袭迁移的可能机制。实验结果一、MENK可以抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长和侵袭迁移1.MENK在体外抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长和侵袭迁移（1）MTT实验结果表明MENK能抑制人鼻咽癌CNE2细胞的增殖,最佳作用时间为72h,IC50为4mg/ml。MENK可以明显改变CNE2细胞的形态,倒置显微镜下见CNE2细胞为扁平梭形细胞,相互衔接排列紧密,经MENK作用后,细胞排列松散,体积变大,核膜出现较多空泡,漂浮细胞增多。（2）流式细胞术分析结果提示MENK通过阻断CNE2细胞的细胞分裂,使CNE2细胞大部分阻滞在G2/M期。经6mg/mlMENK作用48h后,处于G2/M期的CNE2细胞约占29.7%,而对照组为20.8%（p<0.05）;与阴性对照组相比（6.43%）,MENK组细胞凋亡率为17.1%,二者差异显著（p<0.01）,提示MENK有效抑制了CNE2细胞的分裂、促进了CNE2细胞的凋亡;（3）qRT-PCR检测到人鼻咽癌CNE2细胞有阿片受体MOR（μ）、DOR（δ）、KOR（k）及ZETA（ξ）的表达。经6mg/ml的MENK作用后,阿片受体表达情况较阴性对照ctrl组明显增多,并且差异有统计学意义（p<0.05）;（4）划痕实验结果显示:MENK能明显抑制CNE2细胞的迁移能力。与阴性对照组的62.13%相比,MENK组伤口愈合率仅达17.57%,差异有统计学意义（p<0.01）;而与MENK组相比,NTX组的伤口愈合率明显增高,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK可能通过作用在阿片受体发挥其抑制CNE2细胞迁移的作用。Transwell侵袭实验结果显示:与阴性对照组Ctrl相比,MENK组穿透成功的细胞数量明显降低,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK有效抑制了CNE2细胞的侵袭能力;而与MENK组相比,NTX组的成功穿透细胞数明显增多,差异有统计学意义（p<0.01）,说明MENK可能通过作用在阿片受体发挥其抑制CNE2细胞侵袭转移的作用。2.MENK在体内可以抑制裸鼠CNE2瘤的生长（1）成功制作荷CNE2瘤裸鼠模型;（2）MENK组CNE2瘤的生长与Ctrl组相比,生长缓慢,42天处死后,MENK组CNE2瘤的体积和重量明显低于Ctrl组,差异有统计学意义（p<0.05）,说明MENK可以抑制体内CNE2瘤的生长;与MENK组相比,NTX组CNE2瘤的重量明显增高,差异有统计学意义（p<0.05）,提示MENK可能通过阿片受体抑制CNE2瘤的生长。（3）瘤组织切片HE染色结果显示,与Ctrl组相比,MENK组瘤细胞的密度降低,胞浆淡染,细胞核气球样变性,核仁明显,核固缩细胞较多,瘤细胞间血管减少,可见裸核的凋亡细胞;与MENK组相比,NTX可以部分抑制瘤组织的病理改变。（4）瘤组织切片免疫组化实验提示与Ctrl组相比,MENK组中OGFr表达增高,胞浆和胞核均有增高,以胞核明显;与MENK组相比,NTX组OGFr表达有所减少,但较Ctrl组相比仍有上调,提示NTX可以部分抑制MENK的上调作用。二、MENK通过多种途径来抑制CNE2细胞的侵袭迁移1.Westernblot筛查提示,与Ctrl组相比,MENK可以上调CNE2细胞中OGFr和E-ca蛋白的表达,下调Slug、Snail、p-smad3、β-catenin和TGF-β 1蛋白的表达,对Vimentin和N-ca蛋白的表达无明显影响,从而推断MENK可能通过调控TGF-β/SMAD通路来抑制CNE2细胞的侵袭迁移能力。2.OGFr-siRNA可以成功瞬时干扰CNE2细胞中OGFr的表达。MENK作用于被OGFr-siRNA干扰的CNE2细胞时其侵袭迁移能力无明显下降（p<0.05）,表明OGFr是MENK发挥作用的关键所在。3.Transwell小室侵袭实验结果提示:与MENK组相比,SB组成功穿透的CNE2细胞数明显增多,差异有统计学意义（p<0.01）,提示拮抗TGF-β/SMAD通路后MENK对CNE2细胞的侵袭抑制作用降低;Westernblot实验结果提示:与MENK组相比,SB组中p-smad3、Slug及Snail等促侵袭的标志蛋白表达有所增多,结合二者结果分析,表明SB431542可以拮抗MENK对CNE2细胞侵袭的抑制作用,提示MENK能通过TGF-β/SMAD通路来抑制CNE2细胞的侵袭能力。4.免疫荧光结果提示OGFr在CNE2细胞的胞浆和核内均有表达,MENK可以上调OGFr的表达,以胞核增多为主;MENK可以下调β-catenin的表达,并且β-catenin表达的降低主要体现在胞核内表达量的减少。结论1.MENK可以直接抑制CNE2细胞的增殖、迁移和侵袭,有效杀伤CNE2细胞。2.MENK可以通过调节OGFr介导TGF-β/SMAD通路而发挥对人鼻咽癌CNE2细胞侵袭抑制的作用。3.MENK可以上调阿片受体OGFr的表达,降低蛋白β-catenin在胞核的表达,有效抑制CNE2细胞的侵袭。