第一部分二代测序技术用于血流感染诊断的研究研究目的探讨m NGS技术对于血流感染诊断的敏感性、特异性及准确性,是否能为血流感染患者的诊断提供新的思路和方法,从而为血流感染患者带来及时而有效的治疗。研究对象和方法根据纳入和排除标准,对2018年2月至2019年7月期间,海军军医大学附属长征医院急救科ICU病区的住院患者进行筛选。最终有74名患者被纳入研究。在患者住院期间,疑似存在血流感染在采集血培养标本送检的同时额外抽取采集血液5ml,用作m NGS检测。收集每位患者基本信息包括性别、年龄(岁)、入院时间、出院时间、患者每次抽取血培养及留取m NGS测序血液样本的留取时间,以及血培养结果(具体病原微生物)、经m NGS所测得的微生物,以及取样时间前后24小时内的其他部位培养的相关病原学结果。使用R(版本3.5.0)进行统计计算。根据m NGS测序所得的病原体的丰度值进行排序。计算m NGS与血培养相比的敏感性、特异性、阳性符合率、阴性符合率,Kappa一致性分析,同时也选取了在ICU内常见的3种细菌计算m NGS技术的敏感性、特异性、阳性符合率、阴性符合率,并行Kappa一致性检验分析。研究结果1、基线特征本研究共纳入海军军医大学附属长征医院急救科ICU病区2018年2月至2019年7月期间疑似存在血流感染的脓毒症患者,根据纳入和排除标准,74名患者,共118例样本被纳入本研究。根据目前诊断血流感染的“金标准”血培养(Blood Culture,以下简称BC)所得出的结果,将患者分为BC阴性组和BC阳性组。BC阴性组男性38例(64%),女性21例(36%);BC阳性组男性12例(80%),女性3例(20%)(P>0.05)。BC阴性组的平均年龄为58.07±16.32岁,BC阳性组的平均年龄58.27±16.49岁(P>0.05)。在ICU住院天数方面,BC阴性组住院天数为20(11,36.5)天和BC阳性组29(18,65)天(P>0.05)。患者的结局中,BC阴性组死亡27人(46%),存活32人(54%),BC阳性组死亡5人(33%),存活10人(67%),(P>0.05)。2、m NGS检测得到的病原微生物在118份m NGS检测的血浆样本中,共测得1438条数据,其中13个样本为阴性结果,阳性结果中共发现细菌205种,真菌62种,病毒20种。3、m NGS检测结果与血培养结果对比通过血培养总计检测到18例阳性结果,其中有17例m NGS检测为阳性结果。在血培养阴性的100例样本中,m NGS检测总计发现了88例阳性结果,通过计算得出m NGS检测对于血流感染诊断的敏感性为94.44%,特异性为12%;阳性符合率为16.19%;阴性符合率为92.31%;Kappa值为0.018963。4、三种ICU常见的革兰阴性菌的m NGS检测结果与血培养结果对比在血培养阳性结果的样本中,含有肺炎克雷伯菌6例,鲍曼不动杆菌1例,未发现铜绿假单胞菌;而通过m NGS检测发现,肺炎克雷伯菌25例,铜绿假单胞菌32例,鲍曼不动杆菌11例。我们分别把m NGS检测结果与这三种细菌的血培养检测结果进行比较。m NGS检测对于肺炎克雷伯菌,敏感性为100%,特异性为77.68%,阳性符合率为19.35%;阴性符合率为100%;Kappa值为0.261392。对于铜绿假单胞菌,特异性为72.88%,阴性符合率为100%;由于血培养未发现阳性结果,故敏感性、阳性符合率、Kappa值无法计算。对于鲍曼不动杆菌,敏感性为100%,特异性为90.60%,阳性符合率为8.3%;阴性符合率为100%;Kappa值为0.140397。5、三种ICU常见的革兰阴性菌的m NGS检测结果与所有部位微生物培养结果的对比我们把患者所有感染部位的(包括血液、痰液、尿液、脓性分泌物、肺泡灌洗液、病灶部位引流液等)通过传统微生物培养技术所得出的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌的结果与m NGS检测结果进行比较。m NGS检测对于肺炎克雷伯菌检测的敏感性为47,22%;特异性为82.93%,阳性符合率为54.84%,阴性符合率为78.16%;Kappa值为0.313712。对于铜绿假单胞菌检测的敏感性为33.33%;特异性为73.79%,阳性符合率为15.63%;阴性符合率为88.37%;Kappa值为0.047972。对于铜绿假单胞菌检测的敏感性为21.95%;特异性为96.10%,阳性符合率为75%;阴性符合率为69.81%;Kappa值为0.216319。研究结论二代测序技术相较于血培养技术,拥有敏感性及特异性高,耗时短,检测范围广的优势。而且该技术可以为临床医生在早期治疗的疑似血流感染而血培养检测阴性的患者时,提供病原学依据,为早期诊断和治疗血流感染提供了新思路。但m NGS对于血流感染诊断过程中,仍无法避免环境污染、抗生素干扰等混杂因素,所以对于血流感染诊断不能依靠单一检测技术,还应结合血培养结果和临床指标综合分析。第二部分基于m NGS探索病毒感染以及细菌多样性对脓毒症患者的影响研究目的基于m NGS技术探讨在ICU的脓毒症患者中病毒感染与脓毒症严重程度的相关性以及其对生存率的影响,细菌种类多样性与脓毒症患者严重程度的相关性。研究方法纳入74名海军军医大学长征医院ICU脓毒症患者。采集患者血液进行m NGS测序。记录患者的临床数据,包括性别、年龄、病程、ICU评分和实验室检查结果。应用单变量和多变量Cox比例风险模型来探索合并存在病毒感染的情况下,脓毒症患者90天死亡率的独立预后因素,以及采用决定系数(R2)线性回归进行连续变量间的相关分析探索细菌种类多样性与脓毒症患者严重程度的关系。研究结果1、基线水平根据m NGS所得出病毒感染情况,将患者分为病毒阴性组和病毒阳性组。病毒阴性组男27例,女10例;病毒阳性组男23例,女14例(P>0.05)。病毒阴性组的平均年龄为53.86±17.03岁,低于病毒阳性组的平均年龄62.35±14.43岁(P<0.05)。在ICU住院天数方面,病毒阳性组住院天数为39.11±28.18天,明显长于病毒阴性组的24.62±28.05天(P<0.05)。所有患者入院时均行APACHEⅡ和SOFA评分,病毒阳性组的APACHEⅡ和SOFA评分均高于病毒阴性组(P均<0.01)。2、病毒感染与脓毒症患者病情严重程度的关系在74例脓毒症患者的整个队列中,基于Cox单因素分析,观察到性别、白细胞计数、C反应蛋白、乳酸、SOFA分值和合并病毒感染与脓毒症的严重程度相关。此外,为了纠正可能的混淆,根据Cox回归模型调整了性别、白细胞计数、C反应蛋白、乳酸、SOFA和合并病毒感染等因素。在所有患者组中,发现病毒感染与脓毒症严重程度风险比的增加密切相关。3、病毒感染与脓毒症患者生存率的关系在脓毒症患者中,如果存在病毒感染,对生存率的影响非常明显。从患者入院后第25天开始,病毒阴性组的生存率无明显变化,而病毒阳性组的生存率持续下降。结果提示病毒感染对脓毒症患者的生存有负面影响。4、细菌种类与脓毒症的严重程度的关系我们研究了细菌种类的数量与脓毒症严重程度的相关性。我们使用包括ICU评分(APACHEⅡ评分、SOFA评分)、脓毒症诊断常用的指标(WBC、CRP、PCT、Lac等)作为脓毒症严重程度的判断标准,依次进行相关性分析后,发现细菌种类数量与脓毒症患者的严重程度两者无相关性。为了进一步探索,我们把患者细菌种类≤10种组和细菌种类>10种组再次进行分析,发现细菌种类的数量与脓毒症的严重程度仍无相关性。研究结论脓毒症患者合并病毒感染与脓毒症的严重程度及ICU脓毒症患者的生存率密切相关。细菌种类数量可能与脓毒症的严重程度无关。