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禽流感(Avian influenza,AI)一直是人们关注的话题,已有130多年的历史。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)可感染各种家禽、水禽、野禽或候鸟,近年来发现部分AIV甚至不经适应就可以直接感染人和其他哺乳动物。1997年香港H5N1禽流感感染人致死事件,引起了公众恐慌。最引发大众关注的H5N1亚型属于高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI),被国际兽疫局(Office International Des Epizooties,OIE)定为A类动物疫病,HPAI具有传播快、危害大、病死率高的特点,不仅感染家禽也可感染哺乳动物,人感染HPAI后死亡率可达33%。其实,在家禽群中流行最为普遍的是H9N2亚型AIV,它属于低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI),家禽感染后一般不表现出明显的临床症状,死亡率也非常低。当H9N2亚型AIV和其他病原混合感染时,家禽临床症状明显,H9N2亚型AIV可以提供多个内部基因节片,形成新的重组病毒。据研究,H7N9亚型AIV的6个内部基因来源于H9N2亚型。因此,加强H9N2亚型AIV感染与致病机制的研究,对评估流感大流行的趋势,保障养禽业发展和保护人类健康,制定有效防控措施具有重要指导意义。禽流感病毒基因组是由8段独立的单股负链RNA片段组成,PA基因是其中之一,主要编码流感病毒PA蛋白,研究表明,该蛋白与流感病毒的宿主特异性和适应性密切相关。2009年新甲流可以在人群间经气溶胶高效传播,PA基因是决定因素之一。本研究以H9N2亚型AIV SD01亲本毒株为骨架,利用反向遗传操作技术,用(2009)新型甲型H1N1流感病毒SD07株的PA基因进行替换,研究PA基因对H9N2亚型AIV致病力和气源性传播能力的影响。主要分为以下几个部分:一、rSD01-PA重组株病毒的拯救与鉴定根据同源重组构建载体原理,利用自行设计的同源重组引物和Robert Webster博士惠赠的双向转录表达载体pHW2000,构建出H9N2亚型AIV SD01亲本毒株的8个转录/表达质粒和(2009)新型甲型H1N1流感病毒SD07株PA质粒并测序验证。用SD07株PA质粒和SD01亲本毒株的其它7个质粒共转染293T细胞,拯救出rSD01-PA重组病毒株。检测并计算EID50:SD01株为9.31±0.27/mL,rSD01-PA株为8.27±0.20/m L,相差1.04 EID50/m L。抗原特性检测结果显示PA基因的替换没有影响毒株的抗原特异性。二、病毒在SPF鸡的致病及传播实验将SD01亲本毒株和rSD01-PA重组毒株分别稀释至106-108EID50,每个稀释度接种5只4周龄SPF鸡。5pdi每组随机取3只剖杀取肺组织,测定组织内病毒滴度,结果表明同等剂量的病毒接种SPF鸡后,两株病毒在其肺组织内的病毒滴度差异性不显著(p>0.05)。随着接种剂量增大,病毒在肺组织内的滴度也相应的增大。病毒PA基因替换并没有影响其在SPF鸡肺组织内的复制能力。在SPF鸡正负压隔离器内进行病毒气溶胶传播实验,将60只SPF鸡随机均分为接种组,直接接触组和气溶胶被动感染组。定期采集口咽泄殖腔棉拭子、血清样品和空气样品进行检测。结果显示,SD01株的传播实验中,气溶胶被动感染组鸡群口咽泄殖腔棉拭子检测到病毒且血清中检测到抗体,接种4dpi检测到气载AIV,8dpi达到高峰,随后逐渐降低。而rSD01-PA组的传播实验中,接种组和直接接触组的口咽泄殖腔棉拭子检测到病毒,血清中检测到抗体;气溶胶被动感染组未检测到排毒,抗体检测为阴性;未收集到AIV气溶胶颗粒。传播实验显示,rSD01-PA重组病毒株失去了其亲本株具有的在SPF鸡群间气源性传播能力。说明新甲流PA基因与SD01的7个基因重组后的新病毒,丧失了形成气溶胶的能力。三、病毒在豚鼠的致病及传播实验为检测SD01亲本毒株和重组毒株rSD01-PA对豚鼠的致病性,各取250g清洁级雌性豚鼠5只,鼻内接种300μL 107EID50病毒液。5dpi分别取3只豚鼠的脑、鼻甲骨、气管、肺、肾,研磨后测定病毒滴度。结果表明,SD01亲本毒株接种豚鼠后未能感染豚鼠在上述器官复制,以致检测不到病毒;而rSD01-PA重组毒株可以在豚鼠鼻甲骨和气管复制,分别达到3.76±0.64/g和4.32±0.48/g的滴度。说明PA基因的替换使得rSD01-PA重组毒株获得感染豚鼠,在其鼻甲骨和气管复制的能力。利用清洁级豚鼠正负压隔离器,进行rSD01-PA重组病毒在豚鼠间的传播实验。将15只250g雌性清洁级豚鼠随机分为攻毒组、直接接触组和气溶胶被动感染组,定期采集鼻洗液样品、血清样品和空气样品进行检测。结果表明,接种组和直接接触组豚鼠鼻洗液样品中检测到病毒并且血清中检测到相应抗体,但是气溶胶被动感染组豚鼠鼻洗液中检测不到病毒,血清中也未检测出抗体。隔离器内气载AIV检测为阴性。传播实验说明,替换PA基因拯救的rSD01-PA重组毒株获得感染豚鼠的能力,并且可以通过直接接触方式感染接触组豚鼠,但不能通过气溶胶传播病毒感染豚鼠。说明(2009)新型甲型H1N1流感病毒PA片段增强了毒株跨越种间屏障感染哺乳动物的能力。