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前言骨发育和骨修复依赖于间充质干细胞向成骨祖细胞-成骨前体细胞-骨细胞的谱系分化。这个分化过程中涉及到许多重要调节分子,例如组织特异性的转录因子Runx2,Osterix;细胞因子BMP,Wnt,FGF;骨基质蛋白合成因子Col Ⅰ,OCN,BSP。除了上述分子,近年来长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）在骨生物学领域中有关成骨的研究受到越来越多研究人员的关注,其对骨发育和骨修复的调控也逐渐被揭示。长链非编码RNA（LncRNA）是一种被认为没有编码能力的一种RNA,链长大于200nt。最初,LncRNA在基因组转录中作用有限,被认为是其中的“噪音”。它是RNA聚合酶Ⅱ在参与转录时产生的,被认为是一种“无用”的基因,即不具有生物学功能。但近几年来,该基因被很多研究者注意到,它在生理调控中同样发挥重要作用,染色体沉默、染色质修饰等功能逐渐被发现,并且它在转录激活和干扰、核内运输等过程中的作用均已经被得到证实。此外,它也在细胞增殖等许多生命活动起到了调节的作用。所以它也是人体中一种非常重要的基因,因此受到了大家的关注,对该基因的研究也越来越丰富。最近,LncRNA在骨发育和骨修复的调控逐渐受到关注,本课题主要研究和探索了通过DNA微阵列（microarray）分析发现的LncRNAHOTTIP在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的调控作用和分子机制。目的:对LncRNAHOTTIP进行生物信息学分析,并在骨髓间充质干细胞中过表达和敲减LncRNA HOTTIP鉴定其对成骨分化的影响,探索LncRNA HOTTIP促进成骨分化的分子机制研究,并在动物模型中验证LncRNAHOTTIP促进骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。方法:（1）利用Ficoll淋巴细胞分离液提取人的骨髓间充质干细胞（BMSC）,并培养进行扩增。借助形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面Marker,鉴定细胞纯度;（2）对细胞进行成骨分化诱导,提取RNA,进行基因芯片检测,得到数据后并分析高表达的LncRNA;（3）利用PCR、免疫印迹（Western Blot）技术检测BMSC成骨分化过程中HOTTIP的表达情况与成骨标志物Runx2的表达情况,并利用茜素红染色判断最后细胞矿化的程度;利用shRNA在BMSC中对HOTTIP进行敲减,利用PCR技术验证敲减的成功,利用茜素红染色及定量判断敲减HOTTIP后BMSC的矿化变化,利用WB技术检测成骨指标ALP、Runx2、Osterix的变化;利用慢病毒在BMSC中对HOTTIP进行过表达处理,利用PCR技术验证过表达的成功,利用茜素红染色及定量判断过表达HOTTIP后BMSC的矿化变化,利用WB技术检测成骨指标ALP、Runx2、Osterix的变化。（4）利用慢病毒在骨髓间充质干细胞（BMSC）中过表达HOTTIP后,通过PCR、免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光技术检测下游β-catenin的变化;构建稳定过表达HOTTIP的BMSC,在过表达HOTTIP的BMSC中利用shRNA敲减β-catenin和利用XAV（β-catenin抑制剂）抑制β-catenin的活性,并通过茜素红染色及定量检测BMSC的矿化,通过PCR、WB检测成骨指标的变化。（5）在稳定过表达HOTTIP的骨髓间充质干细胞（BMSC）利用shRNA对WDR5进行敲减,通过PCR技术验证敲减效率,对过表达HOTTIP的BMSC进行成骨分化诱导,通过茜素红染色及定量对BMSC的矿化进行检测,并利用PCR、免疫印迹（Western Blot）技术检测成骨指标的变化;利用shRNA敲减HOTTIP的骨髓间充质干细胞（BMSC）对WDR5进行过表达,通过PCR技术验证过表达效率,对敲减HOTTIP的BMSC进行成骨分化诱导,通过茜素红染色及定量对BMSC的矿化进行检测;在敲减WDR5的骨髓间充质干细胞（BMSC）中利用PCR技术检测β-catenin的mRNA;利用荧光原位杂交技术（FISH）对HOTTIP进行细胞亚定位检测;利用免疫荧光技术对WDR5进行细胞亚定位检测。利用RNA免疫沉淀、RNA pull down技术检测HOTTIP与WDR5的结合情况;（6）利用染色质免疫共沉淀技术（ChIP）检测WDR5与β-catenin启动子的结合情况。（7）构建稳定过表达HOTTIP的骨髓间充质干细胞（BMSC）,将BMSC在体外培养于胶原支架上,并将胶原支架移植于裸鼠的皮下,通过Micro-CT检测骨形成的大小与密度,通过免疫组化（IHC）技术检测成骨指标OCN的表达情况。并给予XAV（β-catenin抑制剂）抑制β-catenin的活性,通过上述方法检测终末成骨分化情况。结果:（1）成骨分化过程中差异表达的LncRNA微列阵图谱中发现HOTTIP升高,生物信息学分析显示HOTTIP在物种间高度保守;在BMSC的成骨分化过程中,HOTTIP逐渐上调;敲除HOTTIP抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化;过表达HOTTIP促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。（2）LncRNAHOTTIP在成骨分化过程中促进β-catenin的表达升高及核定位增加;敲减β-catenin与抑制β-catenin的活性将导致HOTTIP促进成骨分化的效应降低。敲减WDR5将导致HOTTIP促进成骨分化的效应降低,而过表达WDR5则能挽救敲减HOTTIP带来的成骨分化效应降低;WDR5能促进β-catenin的转录;在BMSC成骨分化过程中,HOTTIP的核定位增加;HOTTIP与WDR5相互结合;敲减HOTTIP后,WDR5的核定位减少,且其与β-catenin启动子的结合也减少。（3）与对照组相比,稳定过表达HOTTIP的BMSC移植到小鼠体内后成骨体积更大,骨密度更高,成骨指标OCN表达更多;而给予XAV干预β-catenin的活性后过表达HOTTIP带来的促成骨效应降低,骨形成体积、骨密度、成骨指标OCN表达情况都不及过表达HOTTIP组。结论:LncRNAHOTTIP在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中逐渐上调;HOTTIP通过与WDR5结合,促进其核定位增加,进而促进其与β-catenin启动子的结合而增加β-catenin的转录,进而激活Wnt/β-catenin通路,促进成骨;LncRNAHOTTIP在体内可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,并同样依赖于Wnt/β-catenin 通路激活。