猪细小病毒(PPV)是细小病毒科中以猪为宿主的一类能导致猪群流产、腹泻以及呼吸道等症状的病毒的统称。近年来国内外陆续报道出PPV2等多种新型的猪细小病毒,且以PPV2为代表的新型猪细小病毒在猪群中的阳性率居高不下,给世界养猪业带来重大的威胁。本研究利用PCR方法调查了 PPV2等新型细小病毒在我国不同地区的流行情况,并对PPV2 ORF2基因进行了测序分析;利用原核的大肠杆菌经典表达系统和真核的昆虫细胞/杆状病毒表达系统同时表达了 PPV2VP蛋白主要抗原表位区,并对其免疫原性进行了研究;同时还利用原核表达的PPV2VPb蛋白建立间接ELISA检测方法,为PPV2的血清学检测提供了支持。具体研究内容如下:1.新型猪细小病毒的检测及猪细小病毒2型ORF2基因的序列分析本研究对2013-2014年本实验室采集保存的253份组织样品进行了 PCR检测;并对PPV2进行ORF2基因的扩增与测序。结果显示PPV2、PPV3、PPV4和PBoV 的检出率分别为 54.5%、11.1%、8.7%和 9.9%,且 PPV2、PPV3、PPV4 存在着一定的季节性流行;对PPV2基因测序显示,不同地区来源的PPV2 ORF2基因之间的同源性为92.6%-100%,对其进行进化分析,结果显示,PPV2和PPV3以及人细小病毒4、5型一同归入PARV4-like virus。本研究为进一步调查新型猪细小病毒流行病学以及PPV2的遗传进化分析奠定了基础。2.猪细小病毒2型(PPV2)VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及其免疫特性研究本实验利用原核表达系统分别表达了 PPV2 ORF2 VP蛋白的第172-412(VPa基因514-1236)位和第713-924(VPb基因,2137-2772)位氨基酸的两段截短蛋白;纯化的蛋白制备成亚单位疫苗免疫小鼠,通过测定抗体效价判定两组蛋白的免疫原性。结果显示,两组蛋白在大肠杆菌中均成功获得表达;小鼠免疫实验表明,两组蛋白均能诱导小鼠产生特异性抗体,但VPb蛋白免疫小鼠产生的抗体效价明显高于VPa,表明VPb蛋白的免疫原性优于VPa蛋白。本实验初步探讨了两种蛋白的免疫原性,为建立PPV2血清学检测方法奠定了基础。3.猪细小病毒2型(PPV2)VP蛋白主要抗原表位区的真核表达及其免疫特性研究本实验将 PPV2 ORF2 的 VPa 基因(514-1236)和 VPb 基因(2137-2772)克隆入转移载体pFastBacTMDual,转化DH10Bac后进行重组,形成重组Bacmid,提取重组Bacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,经Western-blot方法鉴定重组蛋白VPa和VPb在Sf9中的表达。表达的蛋白制备成亚单位疫苗免疫小鼠,通过测定抗体效价判定两组蛋白的免疫原性。结果显示,两组蛋白均成功获得表达;小鼠免疫实验表明,经三次免疫后VPb蛋白免疫小鼠产生了较高的抗体效价,而VPa蛋白免疫小鼠产生的抗体效价很低,表明VPb蛋白的免疫原性优于VPa蛋白。本研究为进一步研究VPa蛋白和VPb蛋白的免疫特性以及PPV2VP亚单位疫苗的研发奠定了基础。4.猪细小病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立和应用本研究选择了原核表达的VPb蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1:100,酶标二抗的工作浓度为1:20 000,检测的临界值为0.4005(OD≥ 0.4005判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型(PPV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪口蹄疫病毒(FMDV)血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性实验变异系数均小于10%。应用此方法对江苏地区的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。该结果表明,以此pET-32a-VPb蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。本研究为临床新型细小病毒的流行病学研究奠定了理论基础,同时为PPV2的遗传进化分析提供了支持。建立的间接ELISA检测方法,为PPV2血清学检测方法的研究奠定了基础。