目的还贝止咳方为山西省中医院临床经验方,对于治疗小儿咳嗽变异性哮喘疗效显著。为了阐明其药效物质基础,本研究采用谱效相关性分析及血清药物化学对还贝止咳方止咳作用的药效物质基础进行研究,为该方的新药研发及质量控制奠定基础。方法1.基于谱效关联技术对还贝止咳方止咳作用的药效物质基础进行研究。以咳嗽潜伏期、咳嗽次数和以小鼠肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量为考察指标,对还贝止咳方水提物、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层的止咳作用进行研究;采用高效液相色谱法建立还贝止咳方不同极性部位的HPLC指纹图谱,将不同极性部位的图谱进行对比,以水提物图谱为参照,得到各部位指纹图谱的共有峰和相应的峰面积;采用双变量相关分析将药效学实验数据与共有峰面积进行关联;基于单味药及对照品的HPLC图谱对关联度较高的色谱峰进行归属和指认。2.基于血清药物化学技术对还贝止咳方止咳作用的药效物质基础进行研究。采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法建立还贝止咳方体外供试品溶液在正、负离子模式模式下的总离子流图,利用准分子离子峰、碎片离子等信息,对比数据库及现有文献对分离出的化合物进行推测和鉴定;在相同条件下建立还贝止咳方含药血清及空白血清的总离子流图,将二者的差异图谱与体外供试品溶液的总离子流图进行对比研究,对还贝止咳方入血成分进行推测和表征。结果1.谱效相关性研究(1)不同极性部位止咳活性研究与空白组相比,模型组肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量均显著升高(P<0.05),说明造模成功。与模型组相比,水提物、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层对于小鼠咳嗽次数、肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量均有下调趋势,且均可以延长小鼠的咳嗽潜伏期,提示还贝止咳方水提物、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层对于小鼠咳嗽均具有一定的治疗作用。(2)不同极性部位指纹图谱的建立通过对供试品制备条件及色谱条件进行优化,建立还贝止咳方水提物的HPLC特征图谱,并进行方法学考察,证明该方法稳定可行。在相同条件下建立其不同极性部位的指纹图谱,以水提物图谱为参照,经色谱工作站处理,得到各部位指纹图谱的共有峰和相应的峰面积,其中,水提物共有46个共有峰,乙酸乙酯层有45个共有峰,正丁醇层有43个共有峰,水层有3个共有峰。(3)不同极性部位止咳作用的谱效相关性分析通过双变量相关分析表明,有7个色谱峰的含量与咳嗽潜伏期呈显著正相关性,分别为12、13、29、32、33、35、39号峰,其中32号峰具有极显著性意义;有4个色谱峰的含量与咳嗽次数呈显著负相关性,分别为12、13、32、33号峰,其中13、32号峰具有极显著性意义,表明这7个峰对于还贝止咳方止咳作用发挥的贡献较大。此外,还有15个色谱峰与药效学实验结果相关性也较强,分别为1、5、6、8、9、10、18、19、20、21、23、36、38、40、41号峰,但不具有显著性意义,说明这些成分对该方的止咳作用也具有一定的贡献。(4)基于单味药及对照品指认分析活性成分通过与方中各单味药的HPLC图谱进行对比,对共有峰进行归属,并通过对照品进一步指认,证明方中5、9、12、14、17、24、25、26、27、33、44、46号峰分别为新绿原酸、苦杏仁苷、绿原酸、咖啡酸、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素。其中新绿原酸、苦杏仁苷、绿原酸和黄芩苷为谱效相关性研究中与该方止咳作用相关性较高的峰,且绿原酸和黄芩苷具有显著相关性。2.血清药物化学研究(1)体外化学成分的定性分析通过数据库比对及文献查阅,还贝止咳方体外供试品溶液共分离出化合物68种,推测和鉴定出64种,包括黄酮类化合物38个,有机酸类化合物10个,萜类化合物6个,含氮化合物10个,其中10个化学成分经对照品确证。(2)入血成分分析通过对空白血清及含药血清图谱进行比对,生成的差异图谱中共显示入血成分28种,通过与还贝止咳方体外供试品总离子流图进行比较,其中9种为原型成分,19种为代谢产物。结合现有文献报道,共推测及指认出24中成分,其中大部分为黄酮类及有机酸类化合物的原型及代谢产物。结论采用谱效相关性研究及血清药物化学两种不同的方法从不同的角度阐明还贝止咳方止咳作用的药效物质基础为黄酮类及有机酸类化合物,为该方新药研发、质量控制等奠定了基础。