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凋亡(apoptosis),也称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是细胞受基因调控的主动死亡形式。而缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)是心血管疾病中一个重要的病理生理过程;研究发现心肌细胞凋亡是再灌注损伤过程中的一个重要机制。因此,寻找抑制心肌细胞凋亡的发生、挽救受损心肌细胞新的治疗方法,对治疗多种心肌细胞凋亡相关性心血管疾病、维护正常心脏功能有重要意义。近年来,研究发现细胞膜内外离子交换的自稳态与凋亡的发生密切相关。在细胞凋亡过程的早期出现的细胞体积减小即凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease,AVD),被认为是一个重要的细胞凋亡的形态学特征。大量证据提示AVD及激活的离子通道在细胞凋亡过程中起着重要的作用,是细胞凋亡的重要前提;氯离子是机体内最重要,最丰富的阴离子,在多种细胞,通过阻断该离子通道及细胞体积减小可以抑制细胞凋亡。因此本实验的目的是在建立I/RI心肌细胞凋亡模型的基础上,观察非特异性氯离子通道阻断剂4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸(4,4’-Diisothiocyanostilb- ene-2,2’-disulfonic acid ,DIDS)对细胞存活及凋亡的影响,并探讨了DIDS对细胞内促存活信号分子磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3’-kinase,PI3K)/Akt及下游分子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)/Bax的影响。研究目的1.建立原代培养乳鼠心肌细胞的缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡模型。2.观察非特异性氯离子通道阻断剂DIDS对缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡的影响。3.探讨氯离子通道阻断剂DIDS对PI3K/Akt存活信号分子及其下游分子Bcl-2、Bax的影响。研究方法1.以原代培养的SD(Sprague-Dawley)乳鼠心肌细胞作为研究对象,并通过缺血/再灌注损伤建立心肌细胞凋亡模型。设立正常对照组、缺血/再灌注组(I/R)、DIDS处理组(I/R+DIDS)及LY294002处理组(I/R+LY294002+DIDS)。2.四唑盐(MTT)比色法观察心肌细胞的存活率;Hoechst 33258染色观察细胞及细胞核形态变化;底物酶解荧光法检测caspase-3活性,反映心肌细胞的凋亡程度;DNA凝胶琼脂糖电泳法测定细胞凋亡。3.免疫印迹方法观察氯离子通道阻断剂DIDS对细胞促存活信号分子PI3K/Akt及其下游分子Bcl-2/Bax的影响。4.免疫荧光双染色观察DIDS对缺血/再灌注损伤心肌细胞内Bax的分布。研究结果1. DIDS组在细胞存活率(85.6 %)、caspase-3活性(180%)与I/R组(52.4%,410%)比较有显著性差异(n=12,P<0.01 DIDS组vs.I/R组),与I/R组比较DIDS能够显著抑制DNA“梯”状条带的形成,Hoechst-33258染色阳性细胞明显减少。说明氯离子通道阻断剂DIDS可以明显抑制I/RI诱导细胞凋亡。2. LY294002处理组与DIDS组比较,呈现细胞存活率降低(58.4%)、caspase-3的活性升高(460%),有明显的凋亡性特征:细胞核碎裂、固缩及明显的DNA“梯”状条带。3.免疫印迹显示,各实验组中总Akt的表达水平无差异(n=12,P>0.05),但磷酸化Akt(p-Akt)表达水平在DIDS组中较I/R组明显升高(n=12,P<0.01 DIDS组vs.I/R组),LY294002处理组中即使加入了DIDS,p-Akt水平与I/R组比较也无差异(n=12,P>0.05 LY294002处理组vs.I/R组);但是LY294002处理组中p-Akt水平较DIDS组明显降低(n=12,P<0.01 LY294002处理组vs.DIDS组)。4.免疫印迹显示,在各实验组中Bcl-2,Bax表达无明显差异(n=12,P>0.05)。激光共聚焦显微镜显示,正常细胞中Bax主要分布在细胞质,I/RI诱导心肌细胞凋亡过程中伴有明显的Bax蛋白向线粒体转位;DIDS可以抑制I/RI诱导的Bax向线粒体转位,而LY294002处理后,细胞重新呈现Bax向线粒体转位。结论1. DIDS能够明显抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡,提高细胞存活率。2. DIDS通过激活PI3K/Akt信号分子,增加p-Akt水平达到抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡。3.在I/RI诱导的心肌细胞凋亡模型上,首次证明了DIDS可能通过抑制了Bax由胞质向线粒体的转位,参与了保护心肌细胞的机制。