论文部分内容阅读
Ghrelin是胃及下丘脑分泌的一种由28个氨基酸组成的天然多肽,由ghrelin O-酰基转移酶(ghrelin O-acyltransferase,GOAT)催化生成的乙酰化ghrelin可以激活促生长激素释放受体1a(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R1a)来发挥生理作用。中枢神经系统内,GHS-R1a在下丘脑弓状核和外侧下丘脑的神经元中表达量最高,参与我们所熟知的促进生长激素释放、调节体重和代谢等生理功能。近年来在下丘脑以外的其它脑区包括皮层、海马、杏仁核、伏隔核、丘脑腹侧背盖区及黑质致密部等都发现了GHS-R1a受体的存在,这提示我们ghrelin及其受体GHS-R1a对多种脑高级功能可能均有重要的调节作用。海马属于大脑边缘系统,包括CA1,CA2,CA3和齿状回(dentate gyrus,DG)等亚区。大量的研究已证实人和动物均需要依赖海马来完成对外界信息的储存加工、学习空间关系及获取位置信息,并且多种神经精神疾病的认知障碍也与海马的病变密切相关。虽然大量前期动物行为学实验已经证实ghrelin/GHS-R1a通路参与学习和记忆的调节,但不同实验室的研究结果并不一致,甚至完全相反,具体原因仍不清楚,可能与研究的脑区、药物剂量、给药方式、动物的饥饿状态、采用的行为范式以及动物的年龄和遗传背景等差异有关。而且迄今为止,ghrelin及其受体GHS-R1a参与学习记忆等脑高级功能的机制并不十分清楚。本研究在总结已有报道基础上,借助基因敲除和海马内低剂量给药的方法探讨了ghrelin及其受体GHS-R1a对海马依赖的学习记忆的调控作用。首先我们观察到Ghsr1a基因敲除(GHS-R1a KO)小鼠海马依赖的空间记忆和场景恐惧记忆明显优于同窝野生(WT)对照小鼠。其次我们发现海马CA1区微量注射ghrelin不影响小鼠的焦虑行为,但可以抑制小鼠空间记忆和场景恐惧记忆的获取,并且GHS-R1a激动剂L-692,585可以模拟ghrelin对学习记忆的作用,而GHS-R1a拮抗剂YIL718预处理能够消除ghrelin对记忆的抑制作用,这与GHS-R1a KO小鼠的行为学结果相一致。这些前期研究结果提示我们在正常生理状态下,ghrelin及受体GHS-R1a抑制而不是促进海马依赖的学习记忆。为了进一步细化不同类型神经元中ghrelin/GHS-R1a通路对学习记忆的影响并探讨可能的分子细胞机制,本研究中我们进一步采用立体定位注射腺相关病毒(AAV-CamkIIa-HA-hM4D(Gi)-2A-GHS-R1a-sfGFP)的方法,选择性在海马兴奋性神经元内过表达GHS-R1a,同时共表达化学遗传元件人毒蕈碱受体4(hM4D(Gi))。通过腹腔注射选择性配体氯氮平(clozapine-N-oxide,CNO),hM4D(Gi)化学遗传工具可以可逆性地操控这些过表达GHS-R1a的兴奋性神经元的活动。借助高架十字迷宫(EMP)、旷场实验(OF)、新物体识别(NOR)、新位置识别(NPR)、Morris水迷宫(MWM)和场景恐惧实验(CFC)等一系列行为学范式,我们对海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a过表达小鼠的学习记忆能力进行了测试。同时,我们利用场电位和全细胞膜片钳技术分别考察了GHS-R1a KO、低剂量ghrelin以及选择性海马兴奋性神经元内过表达GHS-R1a对小鼠海马突触传递及可塑性,以及细胞固有兴奋性的影响,并对ghrelin/GHS-R1a下游信号通路进行了探讨,以揭示ghrelin/GHS-R1a调控记忆的分子和细胞机制。具体研究结果列举如下:1.新物体识别、新位置识别、Morris水迷宫及场景恐惧等与认知相关的行为学实验结果显示,海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达小鼠表现出海马依赖性的记忆障碍,包括物体识别、位置识别和空间记忆障碍,而场景恐惧记忆与对照小鼠比没有差别。2.高架十字迷宫和旷场实验结果显示,海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达不影响小鼠的情绪及自发活动。3.GHS-R1a KO降低了海马CA1区抑制性神经元的固有兴奋性,表现为同一去极化电流诱发的动作电位个数明显减少;静息电位不变;阈电位不变;动作电位的快速后超极化(fast-hyperpolarization potentials,fAHP)幅度增加。而且GHS-R1a KO不影响海马CA1区兴奋性神经元的固有兴奋性,GHS-R1a KO小鼠海马CA1区兴奋性神经元去极化电流诱发的动作电位个数,静息电位,阈电位与同窝对照WT小鼠相比都没有差别。4.Ghrelin(200nM)降低小鼠CA1区锥体神经元的固有兴奋性,即同一去极化电流诱发的动作电位个数明显减少,Ghrelin(200nM)降低阈电位绝对值,但对静息电位无影响。5.海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达降低了小鼠海马CA1区锥体神经元的固有兴奋性,表现为同一去极化电流诱发的动作电位个数明显减少;静息电位绝对值降低;阈电位不变;动作电位刚刚开始爆发时,爆发的第一个动作电位与第二个动作电位的时间间隔变大。6.GHS-R1a KO小鼠海马CA1锥体神经元抑制性突触传递降低而兴奋性突触传递不变。具体表现为自发抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs)频率降低,幅度不变;微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)的频率幅度均受到抑制;自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)和微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)的幅度和频率均无变化。7.Ghrelin(200nM)影响小鼠海马神经元兴奋性突触传递,具体表现为微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)的幅度增高,而频率没有发生改变;自发抑制性突触后电流(sIPSCs),微小抑制性突触后电流(mIPSCs),自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)的幅度和频率均无变化。8.海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达不影响小鼠海马神经元突触传递功能,其自发抑制性突触后电流(sIPSCs),微小抑制性突触后电流(mIPSCs),自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)和微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)的幅度不变,频率不变。9.与同窝对照WT小鼠相比,GHS-R1a KO小鼠海马突触可塑性提高,具体表现为刺激强度-输出反应(input-output curve,I-O curve)增强即在给与小鼠海马区SC-CA1传导束一个80μA或100μA的刺激强度时GHS-R1a KO小鼠兴奋性突触后场电位(excitatory postsynaptic field potential,fEPSP)的斜率增大;小鼠在接受5θ节律刺激(5 theta burst,TBS)后,GHS-R1a KO小鼠长时程增强(long-term potentiation,LTP)的初始阶段(包括PTP,post tetanic potentiation,强直刺激后增强)有显著升高。而配对脉冲比率(paired-pulse ratio,PPR),100Hz高频刺激、2θ节律刺激诱导的LTP无异常。10.Ghrelin(200nM)略微降低突触前递质的释放效率,表现为当两个刺激间隔在25ms时,ghrelin(200nM)处理组小鼠的配对脉冲比率(PPR)高于对照组小鼠,但两个刺激间隔为10ms,50ms,100ms,200ms和400ms时两组PPR均无差别。Ghrelin(5nM)对小鼠海马区I-O curve,PPR以及100Hz高频刺激诱导的LTP无影响;ghrelin(200nM)对小鼠海马区I-O curve、100Hz高频刺激以及5θ节律刺激诱导的LTP也无影响。11.海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达不影响小鼠海马突触可塑性,其I-O curve、PPR和LTP均无异常。12.GHS-R1a KO小鼠海马内蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)磷酸化水平明显低于野生型小鼠。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抑制剂LY294002预处理本身对小鼠神经元的固有兴奋性无明显影响的情况下,LY294002可完全消除200nM ghrelin对海马CA1锥体神经元固有兴奋性的影响。综上所述,我们发现,与前期GHS-R1a KO和海马CA1区微量注射ghrelin的行为学实验结果相一致,海马CA1区注射病毒,在αCaMKII~+神经元内过表达GHS-R1a受体会造成小鼠海马依赖的学习记忆障碍。进一步的研究发现,GHS-R1a KO对小鼠学习记忆的促进作用可能与海马CA1抑制性突触传递降低,抑制性神经元固有兴奋性降低以及突触可塑性增强有关。200nM ghrelin和海马αCaMKII~+神经元内GHS-R1a受体过表达造成的小鼠记忆障碍可能是由海马CA1锥体兴奋性神经元固有兴奋性降低导致的。我们前期的研究结果显示PI3K的抑制剂消除了ghrelin对新位置识别的抑制作用,我们western blot的结果也显示GHS-R1a KO小鼠海马内Akt的磷酸化水平明显低于野生型小鼠,并且PI3K的抑制剂能够消除200nM ghrelin对海马CA1区锥体神经元固有兴奋性的抑制作用,这表明PI3K/Akt信号通路介导了ghrelin/GHS-R1a对神经元固有兴奋性的调控,ghrelin/GHS-R1a激活PI3K/Akt信号通路是抑制海马学习记忆获取的关键。因此我们得出结论,ghrelin/GHS-R1a通路抑制小鼠海马依赖的学习记忆,其机制主要是通过激活下游PI3K/Akt信号通路,导致海马CA1神经元固有兴奋性降低,从而造成学习记忆障碍。对于ghrelin及其受体GHS-R1a作用的讨论已经经历了很长时间,但并无定论,揭开ghrelin及其受体GHS-R1a在整体上发挥作用的背后机制,是深入理解ghrelin/GHS-R1a通路调节学习记忆的关键。因此,在本研究中我们借助ghrelin受体GHS-R1a敲除、海马CA1区低剂量注射ghrelin,以及海马αCaMKII~+神经元内选择性GHS-R1a受体过表达等研究工具,结合多模式海马依赖的行为学检测,系统研究了ghrelin/GHS-R1a通路对海马依赖的记忆获取的调节作用,并深入探讨了其发挥作用的分子细胞机制。研究不仅有助于阐明ghrelin及其受体GHS-R1a调节学习记忆的分子细胞机制,深化我们对学习记忆及其分子细胞机制的认识,同时为包括各种精神疾病如精神分裂、抑郁症、癫痫、成瘾、神经退行性变导致的学习记忆等认知障碍疾病的治疗提供可能的理论指导。从长远来说,这些研究对靶向GHS-R1a受体及其下游分子改善学习记忆药物的开发及应用,对伴有认知障碍的神经精神疾病的病因学研究及治疗将带来深远的影响。