【摘 要】
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目的:通过CRISPR/Cas9技术敲除自闭症易感基因ppp2r5d以建立斑马鱼突变体模型,并通过该模型研究ppp2r5d基因的敲除对斑马鱼早期发育、行为学及大脑转录组学的影响。方法:通过原位杂交实验和RT-q PCR实验获得ppp2r5d基因在斑马鱼早期发育阶段的时空表达谱。利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼进行基因编辑以获得F0代嵌合体,进行传代和筛选后获得F3代纯合突变体。对相同饲养环境
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目的:通过CRISPR/Cas9技术敲除自闭症易感基因ppp2r5d以建立斑马鱼突变体模型,并通过该模型研究ppp2r5d基因的敲除对斑马鱼早期发育、行为学及大脑转录组学的影响。方法:通过原位杂交实验和RT-q PCR实验获得ppp2r5d基因在斑马鱼早期发育阶段的时空表达谱。利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼进行基因编辑以获得F0代嵌合体,进行传代和筛选后获得F3代纯合突变体。对相同饲养环境下同年龄的纯合突变体和对照组进行早期发育观察、形态学测量和免疫荧光染色并进行分析。使用5 dpf和4 mpf的幼鱼和成年斑马鱼分别进行幼鱼明暗刺激行为学试验和成鱼行为学实验（新缸实验、镜子咬合实验、三缸实验和群集实验）。通过RT-q PCR实验检测4.5 mpf成年斑马鱼大脑中情绪相关基因的表达水平。通过对获得的5dpf的突变体和对照组幼鱼的头部组织提取总RNA和RNA测序（RNA-seq）来进行转录组学分析。结果:斑马鱼ppp2r5d基因为母源表达基因,使用CRISPR/Cas9技术成功获得ppp2r5d纯合突变体模型,且发现其幼鱼相较于对照组存在发育延迟、体长缩短、眼间距增大和视顶盖间距扩大等改变,成鱼体长也缩短。ppp2r5d纯合突变体幼鱼在明暗刺激试验中表现出惊吓逃避反应能力、学习和记忆能力下降;突变体成鱼在行为学实验中表现出焦虑和恐惧水平上升,攻击性增强和社交能力缺陷。突变体成鱼脑组织相较于对照组存在HPA轴等基因的表达水平上升。突变体幼鱼相较于对照组的转录组测序结果显示差异表达基因富集到神经系统发育、谷胱甘肽代谢、视黄醇的新陈代谢及对生物刺激的反应等生物学过程,且差异基因中包含多个ASD风险基因。结论:成功获得斑马鱼ppp2r5d的突变体模型,且该突变体相较野生型存在早期发育异常,形态发育异常,以及明显的自闭症样行为学异常。敲除基因的成鱼的脑组织存在情绪相关基因的表达改变。幼鱼突变体脑组织的转录组学结果从分子水平上显示该基因的突变会导致异常的功能继而影响所参与的多种生物学过程。
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