【摘 要】
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脂肪细胞的数量和分布直接影响家畜肉产品的质量,对脂肪形成机制的解析是改善肉品质的基础。脂肪细胞的生成主要包括增殖和分化两个过程,其中受到多种转录因子、生长因子、细胞炎症因子、信号通路、以及包括miRNA在内的非编码RNA的调控。miRNA是在转录后水平上调控基因表达的短ncRNA(非编码RNA,20～22 nt),能够参与各种基本生物学过程。研究表明,miR-99b-5p在仔猪和成年猪皮下脂肪组织
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脂肪细胞的数量和分布直接影响家畜肉产品的质量,对脂肪形成机制的解析是改善肉品质的基础。脂肪细胞的生成主要包括增殖和分化两个过程,其中受到多种转录因子、生长因子、细胞炎症因子、信号通路、以及包括miRNA在内的非编码RNA的调控。miRNA是在转录后水平上调控基因表达的短ncRNA(非编码RNA,20～22 nt),能够参与各种基本生物学过程。研究表明,miR-99b-5p在仔猪和成年猪皮下脂肪组织存在差异表达(P<0.05),因此,本研究预测miR-99b-5p可能在脂肪组织的脂质沉积过程中发挥着重要的调控作用。本论文以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、EdU染色、流式细胞术、CCK8试验分析、油红O和Bodipy染色、蛋白质组学测序以及双荧光素酶报告分析等技术,研究了miR-99b-5p对前体脂肪细胞增殖和分化的作用及其机制。主要获得如下结果:1.组织表达谱分析显示,miR-99b-5p在小鼠肺中表达量最高,在脂肪组织中表达水平适中;在3T3-L1前体脂肪细胞增殖过程中miR-99b-5p的表达量持续上升,而在分化过程中则先上升后下降。这些结果表明miR-99b-5p在前体脂肪细胞的增殖和分化过程中可能起作用。2.过表达miR-99b-5p,显著增加EdU染色和CCK8的阳性细胞数目和细胞活性以及S期的细胞数目,并提高Cyclin D、Cyclin E(P<0.01)、CDK4(P<0.05)的m RNA表达量,抑制p21(P<0.001)的表达;在蛋白水平,Cyclin D、Cyclin E(P<0.05)、CDK4(P<0.05)的表达量显著上升,p21的表达量显著下降(P<0.05)。相反,干扰miR-99b-5p后显示出与过表达相反的结果。上述结果表明,miR-99b-5p促进了细胞的增殖。3.过表达miR-99b-5p,显著减少油红O染色和Bodipy染色中脂滴的数量,并降低PPARγ(P<0.01)、C/EBPα(P<0.001)、Ap2、ATGL(P<0.01)、HSL(P<0.001)的m RNA表达量,在蛋白质水平,SREBP1、PPARγ、Ap2、HSL(P<0.05)的表达量也显著下降。相反,干扰miR-99b-5p后显示出与过表达相反的结果。上述结果表明,miR-99b-5p能够抑制细胞的分化。4.miR-99b-5p通过SCD1和Lpin1抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化。综上所述,miR-99b-5p能够促进前体脂肪细胞的增殖,并且通过靶向SCD1和Lpin1抑制前体脂肪细胞的分化过程,该研究为改善家畜肉品质提供了一定的理论依据。
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