【摘 要】
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DhaA可以通过水解脱卤机制催化芥子气的碳-氯键断裂,生成硫二甘醇和氯离子。该催化反应不会生成有毒的产物和中间产物,且催化效率较高,这使得芥子气的无毒害降解成为可能。然而,DhaA的稳定性较差,这限制了它作为生物酶洗消剂的应用。为了解决这个问题,本论文设计了两种方案以改善DhaA的环境稳定性。第一种方案是用阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）对DhaA进行化学修饰。AG的结构特点
【机 构】
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中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)
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DhaA可以通过水解脱卤机制催化芥子气的碳-氯键断裂,生成硫二甘醇和氯离子。该催化反应不会生成有毒的产物和中间产物,且催化效率较高,这使得芥子气的无毒害降解成为可能。然而,DhaA的稳定性较差,这限制了它作为生物酶洗消剂的应用。为了解决这个问题,本论文设计了两种方案以改善DhaA的环境稳定性。第一种方案是用阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）对DhaA进行化学修饰。AG的结构特点是高度支链化且羟基含量丰富,因此具有一定保护蛋白质的潜力。DhaA的修饰产物AG-DhaA的表观分子量为150kDa,其中AG和DhaA的摩尔比为4.5±1.1,其水化体积是DhaA的70倍左右。AG修饰并未明显改变蛋白本身的结构,仅有部分α-螺旋转化为β-折叠。而且AG-DhaA仍保留有91.1%的酶活性,AG-DhaA和DhaA的Km值分别为1.90±0.44和1.64±0.39,酶促动力学参数也在很大程度上得到保留。与游离的DhaA相比,AG-DhaA的环境稳定性显著提高。在50℃下的半衰期由1.17h延长到了 2.01h;在pH3.0中处理1h后的剩余相对活性由10.6%提高到了 35.2%;在37℃下的半衰期由27.61h延长到了 56.35h;在高盐溶液的半衰期由12.12h延长到了 47.48h。为了进一步提高DhaA的环境稳定性,在多糖修饰DhaA的基础上,本论文还开发了第二种方法。AG-DhaA在最适pH下带有负电荷,可以与带有正电荷的大分子在水相中自组装形成纳米颗粒。本论文选择了两种带有正电荷的大分子:壳聚糖（Chitosan,CTS）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）,使其在水相中和分别和带负电荷的AG-DhaA通过静电相互作用,自组装形成纳米颗粒。其中,PEI-AG-DhaA 的粒径为 82.97±24.77nm,而 CTS-AG-DhaA 的粒径为151.36±69.22nm。与 AG-DhaA 相比,PEI-AG-DhaA 和 CTS-AG-DhaA 颗粒的酶动力学参数和酶活性仅有轻微的损失。PEI-AG-DhaA 和 CTS-AG-DhaA 的环境稳定性进一步提升。PEI-AG-DhaA和CTS-AG-DhaA在50℃下的半衰期分别由3.28h延长到8.55h和5.66h;在pH 3.0条件下处理1h后,其剩余相对活性由22.8%提高到了 35.0%和33.4%;在pH 4.0条件下处理1h后,其剩余相对活性由36.6%提高到了 56.8%和86.2%;在37℃下的半衰期由2.51d延长到了 7.39d和5.38d。其中,PEI-AG-DhaA的热稳定性和储存稳定性高于CTS-AG-DhaA;而CTS-AG-DhaA的pH稳定性高于PEI-AG-DhaA。
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