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目的:已有研究表明,Dicer表达下调能够导致Alu序列在人视网膜色素上皮细胞中累积。此外,Dicer还可能将啮齿类动物的内源性SINE/B1 RNA(相当于灵长类动物的Alu序列)切割成小干扰RNA(siRNA)。Alu的产生源于7SL RNA(一个信号识别颗粒的组分),本课题旨在研究Dicer是否可以切割Alu序列及7SL RNA。
方法:
(1)利用Solexa深度测序技术,分析Dicer敲除和对照组HepG2.2.15细胞的小RNA,探究Dicer是否可以切割Alu序列;运用BLAST和SOAP2软件将小RNA测序结果与人的7SL RNA序列进行比对,分析Dicer是否可以切割7SL RNA;使用人类重组Dicer蛋白对7SL RNA进行体外切割,研究Dicer能否切割7SLRNA。
(2) Northern blot验证Dicer切割7SL RNA生成小分子RNA。
(3)构建7SL RNA的小RNA切割产物(7SL sRNA5cd和7SL sRNA8b)的荧光素酶报告基因载体,在HepG2.2.15和HEK293T细胞中分别进行荧光素酶活性检测,分析这两个小分子RNA与miRNA的功能是否相同。
(4)运用RNA免疫共沉淀技术,研究7SL RNA产生的小分子RNA是否能与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。
(5)在HepG2.2.15和HEK293T细胞中先过表达7SL sRNA5cd或7SL sRNA8b,然后运用ChIP及实时定量RT-PCR技术研究7SL RNA产生的小分子RNA是否能调节7SL RNA的表达。
结果:
(1)在敲除Dicer的细胞中,源于Alu序列的小分子RNA显著减少,表明Dicer在HepG2.2.15细胞中能够切割Alu序列。
(2)小RNA测序结果表明Dicer能够将7SL RNA切割成不同长度的片段(18-23nt),片段主要富集于两个区域,分别命名为7SL sRNA5cd和7SLsRNA8b。Northern-blot证实7SL RNA可被Dicer切割。
(3)7SL RNA来源的小分子RNA(7SL sRNA5cd,7SL sRNA8b)与miRNA(如miR-31)的功能不类似。
(4)7SL sRNA5cd和7SL sRNA8b均不能调节7SL RNA表达。
结论:7SL RNA可以被Dicer切割成不同长度的片段,但是其产物的生物学功能目前还尚不清楚。