论文部分内容阅读
草鱼是中国年产量最大的淡水养殖鱼类,由于高密度养殖模式以及饲料营养因素等导致的草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积,这既损害了草鱼的健康,降低了鱼肉的品质,也严重影响了养殖户的经济效益。有关草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的营养因素研究已经取得了很大进展,但是一些基础性的研究,例如草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的评价标准和发生机制等研究工作相对比较欠缺。建立草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的系列评价指标以及探索其发生机制,将有利于草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的诊断、预防和治疗。本研究以草鱼成鱼为研究材料,初步建立了草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的系列评价指标,并通过基于1H-NMR的代谢组学分析技术、电镜切片以及荧光定量PCR技术等对草鱼成鱼肝胰脏脂肪过量蓄积发生的生理生化机制和分子机制进行了探索性研究。主要研究结果如下：1、基于肝脂的草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积评价指标构建通过物理检测法、全自动生化分析仪以及索氏提取法分别测定了245尾草鱼(平均体质量为1317.60±331.26 g)的4项生物学指标,23项血清生化指标以及肝胰脏脂肪含量。按30法则,取肝胰脏脂肪含量低于5%的草鱼各项指标在68.26%置信区间范围值为各指标正常参考值。将肝胰脏脂肪含量高于5%的草鱼各项指标与参考值进行比较,将平均值明显高于参考值上限的指标确定为草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积间接评价指标，并按3a法则确定各指标评定草鱼肝胰脏脂肪不同蓄积程度的范围值。结果：草鱼肝胰脏正常脂肪含量范围为3.02%—4.60%；肝胰脏脂肪含量为4.60%—7.56%、7.56%—12.74%、>12.74%依次为草鱼肝胰脏轻度、中度、重度脂肪蓄积评价范围值。肝胰脏脂肪过量蓄积草鱼CF、VSI、HSI、MFI、ALT、AST、TBIL、IBIL、ALP、CHOL LDL、GLU平均值均明显高于各指标参考值,初步被确定为草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积间接评价指标。肝胰脏脂肪过量蓄积草鱼体形肥胖,内脏脂肪蓄积严重,部分肝功能受损。2、不同肝脂含量草鱼肝胰脏能量结构及血清抗氧化能力为了从局部水平探讨草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积发生的生化机制,分别采用色谱法、电镜切片以及常规化学分析方法对正常肝脂、肝脂轻度蓄积、中度蓄积、重度蓄积草鱼肝胰脏中腺苷酸含量、肝胰脏超微结构以及血清抗氧化指标等进行了检测和分析。结果表明：肝胰脏ATP含量和能荷均随着草鱼肝脂蓄积程度加重而降低。除中度蓄积组和重度蓄积组ATP、ADP、AMP含量以及能荷差异不显著(P>0.05)以外,其余组间ATP、ADP、AMP以及EC均存在显著差异(P<0.05)。不同肝脂含量草鱼肝胰脏TAN含量相近,差异均不显著(P>0.05)。随着肝脂蓄积程度加重,肝胰脏中脂肪空泡数量增多,脂肪空泡体积变大；草鱼肝细胞线粒体数日减少,线粒体固缩,线粒体结构受损。血清T—AOC以及SOD、GSH-Px、CAT活性均随着肝胰脏脂肪含量增加而下降,则MDA和LPO则随之上升。随着草鱼肝脂蓄积程度逐渐加重,肝胰脏ATP含量和能荷逐渐下降,线粒体结构和功能受损逐渐加重,血清整体抗氧化能力逐渐降低。3、基于1H-NMR分析技术的草鱼肝胰脏及血清代谢组学分析为了从整体水平探讨草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积发生的生化机制,采用1H-NMR分析技术和PCA、PLS-DA、VIP等多元统计分析方法对肝胰脏脂肪含量分别为3%—4%和14%—16%的正常肝脂草鱼和肝脂重度蓄积草鱼的肝胰脏及血清进行了代谢组学研究。结果表明,PCA模型可以很好地区分正常肝脂组草鱼和肝脂重度蓄积组草鱼,且在正常肝脂组草鱼和肝脂重度蓄积组草鱼肝胰脏和血清中分别检测到58种和47种代谢物。葡萄糖、别嘌呤二醇、牛磺酸、乳酸、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、甘氨酸、石碳酸、次黄嘌呤、乙酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸为肝胰脏差异代谢物,其中肝脂重度蓄积组草鱼肝胰脏葡萄糖和别嘌呤二醇含量明显高于正常肝脂组草鱼；乳酸、葡萄糖、肌酸、柠檬酸、亮氨酸、丙酮酸、缬氨酸、脯氨酸、鸟嘌呤核苷、异亮氨酸、谷氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸为血清差异代谢物,其中肝脂重度蓄积组草鱼血清葡萄糖、柠檬酸、脯氨酸、谷氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、精氨酸以及甘氨酸等7种代谢物含量高于正常肝脂组草鱼。相对于正常肝脂组草鱼,肝脂重度蓄积组草鱼肝胰脏内糖酵解和糖的有氧氧化途径均受到明显的抑制。4、不同肝脂蓄积程度草鱼肝胰脏能量代谢相关基因表达为了探讨草鱼肝胰脏脂肪过量蓄积的部分分子机制,采用荧光定量方法,以p-actin基因为内参,对正常肝脂组草鱼和肝脂轻度、中度、重度蓄积组草鱼肝胰脏线粒体有氧氧化功能相关的ND5、COI、UCP2、cytb基因,脂质分解代谢相关的LPL、APO—14 kDa、HSL基因,以及脂质合成关键酶基因ACACA、FAS基因等9个与能量代谢相关基因的mRNA相对表达量进行了比较分析。结果表明：ND5、COI、cytb、APO-14kDa、HSL等5个基因的相对表达量随草鱼肝脂蓄积程度加重而下调,而UCP2、LPL、FAS和ACACA4个基因的相对表达量则随之上调。随着草鱼肝脂蓄积程度加重,线粒体有氧氧化功能和脂质分解途径逐渐被抑制,而脂质合成途径则逐渐被激活。