恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康,已成为人类主要死因之一。手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统疗法,其治疗效果并非尽如人意。随着免疫学、细胞生物学及分子生物学的飞速发展,肿瘤疫苗的研制与应用已成为治疗肿瘤复发、转移的有力手段。但是,现有肿瘤疫苗由于缺乏有效的抗原提呈,以及MHC限制性、肿瘤异质性、疫苗生物利用度差等问题,在走向临床运用的过程中还面临很多困难。黑色素瘤相关抗原MAGE（Melanoma associate antigen）属于肿瘤/睾丸抗原,其中MAGE1、MAGE3是肿瘤免疫治疗的理想靶分子,在多种肿瘤组织中表达而不在正常组织表达（除睾丸和胎盘）,被称为肿瘤特异性共有抗原。热休克蛋白是一种抗原递呈的辅助分子,可以增强肿瘤的免疫原性。在以往本室的研究中已证实MAGE1、MAGE3与HSP70的融合蛋白可以增强动物机体针对MAGE1和/或MAGE3的免疫反应,是一种优良的抗原物质,并构建了“恶性肿瘤基因工程纳米疫苗”。为了进一步提高该疫苗的抗肿瘤免疫活性,提高疫苗的生物利用度,也为了将该疫苗推向临床前研究,逐步进入成果的转化开发,本研究以肿瘤特异性抗原MAGE1、MAGE3与热休克蛋白HSP70融合蛋白等前期研究工作为基础,采用周期短、产率高且稳定可靠的中试发酵工艺,生产了足够后期临床前研究所用的重组蛋白,并对其进行酯化,再以纳米长循环脂质体作为载体,制备恶性肿瘤基因工程纳米脂质体疫苗,而后研究该疫苗对机体细胞免疫和体液免疫的作用,以及该疫苗在小鼠体内的吸收、分布、转化和排泄等过程的速度规律。1.鉴定重组工程菌pET28a-MAGE1/HSP70/MAGE3（MHM）/BL21（DE3）并检测其生物学性状的稳定性。结果显示含有该表达载体的工程菌经IPTG诱导后以包涵体形式表达重组蛋白,新生的蛋白条带能够和抗MAGE1单抗和抗MAGE3多抗特异性结合;对重组工程菌进行摇瓶培养,菌体经裂菌、包涵体的洗涤、溶解变性和透析复性,最后经亲和层析柱纯化获得纯度>80%的重组蛋白;该重组工程菌菌株连续传至50代后,进行质粒性状、扫描电镜观察、融合蛋白表达水平、细菌染色及各项生化反应检测,发现该菌株呈现典型的大肠杆菌形态,生物学形状稳定,可作为生产用菌种。2.为满足临床前各项实验的需要,将工程菌发酵和蛋白纯化工艺放大至中试规模。采用溶氧反馈-分批补料培养方式,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等条件进行优化,在20L发酵罐中连续进行了三批工程菌发酵,工程菌生长正常,目的蛋白MHM和M3H的表达量均大于35%,保证了工程菌的稳定性;对实验室摸索的蛋白纯化工艺进行改进,连续纯化了三批M3H融合蛋白,纯度均在90%以上,生产规模达到中试要求;通过对融合蛋白的理化性质、纯度、生物学活性和残留杂质等几方面的控制,确认目的蛋白符合基因工程药物质量标准的要求。3.为有效提高脂质体包裹大分子蛋白的包封率,提高肿瘤抗原的生物利用度,运用化学合成方法将肿瘤特异性抗原融合蛋白与硬脂酸交联,使融合蛋白酯化后再进行纳米包裹,成功制备出平均粒径为87.9nm（CV=0.371）的衍生肿瘤抗原纳米脂质体疫苗,其药物包封率达到86%,显著高于单纯肿瘤抗原纳米脂质体（37%）,有效增强了抗原的生物利用率。该疫苗于4℃放置6月后无沉淀及分层,具备优良的理化性质。通过IFN-γELISPOT和LDH释放实验检测疫苗激活小鼠特异性细胞免疫反应的情况,发现该疫苗比游离蛋白疫苗能更好的诱导机体产生针对MAGE3的特异性CTL,对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用。间接ELISA结果显示,该疫苗能够提高机体MAGE3的抗体水平,有效激活小鼠的体液免疫反应。4.在小鼠体内对该疫苗进行了药代动力学研究,首先制备¹²⁵I标记的衍生融合蛋白(¹²⁵I-SA-MH)和¹²⁵I标记的衍生融合蛋白脂质体(¹²⁵I-L-SA-MH),小鼠单次给药后,三氯醋酸（TCA）沉淀法测定血浆、组织、尿和粪的放射性含量,3p97软件拟合药物动力学模型,并计算相应参数。结果显示,¹²⁵I-SA-MH和¹²⁵I-L-SA-MH单次静脉注射后在小鼠体内的动力学过程符合两室模型。在相同剂量条件下,¹²⁵I-L-SA-MH分布相半衰期T1/2α和消除相半衰期T1/2β和AUC均有所增加;¹²⁵I-SA-MH的总体清除率比¹²⁵I-L-SA-MH大,证明脂质体包裹能保护药物,有一定的缓释作用,可进一步提高药物的生物利用度。体内分布试验结果表明,¹²⁵I-SA-MH进入血液后首先迅速聚集到肝脏,而¹²⁵I-L-SA-MH进入血液后则到脾脏发挥作用。排泄实验结果显示,¹²⁵I-SA-MH和¹²⁵I-L-SA-MH主要通过泌尿系统排泄。综上所述,我们研制的“恶性肿瘤基因工程纳米疫苗”能有效激发机体的细胞和体液免疫反应,杀伤肿瘤细胞;药代动力学显示该药物具有靶向性、缓释性及较高的生物利用率;同时还建立了稳定的中试发酵和蛋白纯化生产工艺,为进行临床前研究及药物开发奠定了基础。