论文部分内容阅读
异喹啉类化合物(isoquinolines)是一类以异喹啉或四氢异喹啉为基本母核的化合物。这类化合物数量庞大、结构复杂,主要分布在约27科植物中。研究发现,一些异喹啉类化合物具有松弛KCl引起的血管平滑肌收缩作用,但敏感性明显不同。就目前研究所知,异喹啉类化合物通常含有1～3个异喹啉环,由此我们推测异喹啉环是该类药物结构的活性中心,但其与平滑肌松弛效应是否存在直接的构效关系还不甚明确。本课题选取20个异喹啉生物碱,其中包括中药莲子心中的8个异喹啉类生物碱,来研究其松弛KCl引起的肠血管平滑肌收缩的构效关系,并筛选出作用较强且作用不可逆的生物碱做为靶标,寻找获得与此类化合物结合的靶蛋白,为阐明异喹啉类药物作用的分子机制奠定基础,并为药物分子合理设计提供依据。1.莲子心异喹啉类生物碱成分的分离纯化及鉴定采用中压制备柱及制备型高效液相色谱分离纯化技术,从莲子心总生物碱中分离,纯化生物碱单体成分,并利用1H NMR及13C NMR进行核磁鉴定。结果分离纯化出7种生物碱单体成分,即荷叶碱(Nuciferine,Nuc)、原荷叶碱(Pronuciferine,Pro)、莲心碱(Liensinine,Lien)、异莲心碱(Isoliensinine,Iso)、甲基莲心碱(Neferine,Nef)、亚美罂粟碱(Armepavine,Arm)及莲子心新碱(Neoliensinine,Neo)。采用这两种色谱分离技术,不仅能得到较纯的生物碱成分,而且缩短了分离的时间,分离方法也较稳定成熟。2.异喹啉生物碱对小鼠肠血管平滑肌松弛作用的研究剥离小鼠肠系膜二级血管,利用微血管张力测定仪,测定20个含不同异喹啉环的异喹啉生物碱对KCL刺激的小鼠血管平滑肌松弛作用,并计算各化合物的IC50值,研究异喹啉环的个数与平滑肌松弛效应的构效关系。实验结果发现20个不同浓度的异喹啉生物碱对小鼠血管平滑肌均有松弛作用,但效果不同。当异喹啉环个数到达2个后,其作用力就有可能表现为不(或弱)可逆,这说明异喹啉环的数目与化合物的亲和力密切相关。3.异喹啉生物碱对小鼠肠血管平滑肌松弛作用的机制研究3.1异喹啉生物碱对肌球蛋白调节轻链磷酸化水平的影响为探究异喹啉类生物碱松弛小鼠肠血管平滑肌的作用机制,是否与抑制肌球蛋白轻链磷酸化有关。本文从20个异喹啉生物碱中,选取作用力最强的粉防己碱(Tetrandrine,Tet)及作用力较强且作用不可逆的莲子心新碱(Neoliensinine,Neo)为研究对象,分别作用于124mMKCL刺激的小鼠肠系膜血管平滑肌,并对作用后的血管提取收集蛋白,用蛋白质印迹法(Western blot)验证其对肌球蛋白调节轻链磷酸化水平的影响。实验结果发现,Tet及Neo均能对肌球蛋白轻链磷酸化有一定的抑制作用。3.2异喹啉生物对小鼠肠血管平滑肌松弛作用的分子机制研究为阐明异喹啉类生物碱作用的分子机制,利用最新的光化学技术方法,寻找获得与该类化合物结合的靶蛋白。以莲子心新碱为主要筛选对象,采用一种新的生物分子TFPA-PEG3-Biotin作为捕获工具,直接从大分子复杂混合物中确定具体的Neo结合蛋白。复合物中的Biotin部分与Neutr Avidin Agarose Resin亲和树脂结合,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,找出差异蛋白,其分子量在35～40KDa范围之间,并利用LC-MS/MS鉴定蛋白,最终确定为蛋白磷酸酶(PP1C)上的催化亚基。