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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计,目前全世界HCV感染患者约有1.8亿人,感染率约为3.0%,其中约75-85%患者会发展为慢性肝炎,最终约20%会发展为肝硬化、肝细胞癌等终末期疾病,对人类的健康和生命构成了严重威胁。HCV感染与转归涉及到HCV的生物学特点、宿主免疫、遗传背景和环境因素之间的作用,相互关系十分复杂。研究表明,HCV核心蛋白(C蛋白)与病毒颗粒组装、慢性肝炎进展以及肝癌发生发展有密切关系,如HCV C蛋白能转录性上调c-myc、c-fos和Bcl-2活性,通过激活NF-κB转录因子途径抑制Fas或TNF诱导的细胞凋亡,并与ras基因起协同作用使肝细胞向肿瘤表型和肝癌细胞转化。近年来,研究者在HCV患者血清中发现了一种新的蛋白,被命名为F蛋白,它是HCVC基因编码的另一个产物。F蛋白是C基因移码读框后所形成的,与C蛋白同时存在,而以往对C蛋白的研究并未排除F蛋白的作用,所以F蛋白的发现对C蛋白产生了新的认识,认为以往属于C蛋白的部分生物学功能可能归功于F蛋白。为探讨上述问题,本研究从三个方面来探讨F蛋白对HCV感染慢性化及转归的可能机理：第一,通过体外实验分析F蛋白表达对慢性肝炎患者外周血单核细胞分泌细胞因子的影响,进一步研究机体对HCVF蛋白的免疫应答能力；第二,通过分析HCV感染者F基因区变异与病毒复制、肝损伤和机体Thl/Th2免疫应答关系,探讨HCVF基因变异在HCV致病中的作用；第三,通过分析HLA-DPA1/B1基因多态性与HCV感染慢性化和F蛋白产生的关系,综合评价病原(HCV分型、准种、F蛋白)-宿主(HLA-Ⅱ类基因)-Th细胞免疫应答-环境和高危行为因素在HCV感染慢性化中的作用及其相互关系,阐明HCVF蛋白参与调控Th1/Th2漂移的分子机制。研究结果将有助于阐明HCV感染特点和转归的可能机理,也为深入研究HCV感染慢性化机制和肝癌的防治提供一定的理论基础。第一部分HCVF蛋白表达对慢性丙型肝炎患者外周血单核细胞分泌细胞因子的影响目的：探讨HCV F蛋白表达对慢性丙型肝炎患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)分泌细胞因子的影响。方法：收集慢性丙型肝炎患者(CHP)和健康对照者(HC)血样,检测CHP血清中抗F蛋白抗体(F-Ab)阳性率并将其分成3组：F-Ab(+)CHP、F-Ab(-)CHP和HC组；磁珠法分离患者和对照组PBMC和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell, PDC),分别用F蛋白、C蛋白刺激,72h后以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测细胞上清干扰素a (interferon-a, IFN-a)和白介素10(interluekin-10, IL-10)水平；利用流式细胞术(FCM)检测PDCs凋亡水平。结果：F-Ab(-)CHP组IFN-a水平高于F-Ab(+)CHP组,F-Ab(-)CHP组IL-10水平低于F-Ab(+)CHP组；在加入rIL-10中和抗体后F-Ab(-)CHP组和F-Ab(+)CHP组IFN-a水平明显升高；此外,研究结果发现F蛋白和C蛋白都可诱导PDCs发生凋亡。结论：在体外培养的PBMC和PDC中,F蛋白至少可通过两条途径来抑制PBMCs和PDCs对IFN-a的分泌,一是上调IL-10的分泌水平,二是诱导PDCs发生凋亡。第二部分丙型肝炎病毒感染者F基因区变异临床意义的初步研究目的：探讨HCVF基因区变异的临床意义。方法：以78例未治疗慢性丙型肝炎患者为研究对象,采用单链构象多态性分析法(SSCP)对HCV F基因区进行准种分析,实时荧光定量聚合酶链反应对HCVRNA进行定量检测,利用ELISA分别对患者血清中的抗F蛋白抗体、Th1(IL-12, IFN-y)和Th2(IL-5, IL-10)细胞因子水平进行检测分析。结果：78例慢性丙型肝炎患者中有46例为抗HCVF抗体阳性,阳性率为59%。HCVlb亚型患者F基因区准种数目明显高于非HCVlb亚型(P=0.002)。F基因区SSCP条带数与HCV RNA载量及ALT/AST水平呈正相关(均有P<0.05)。另外,与F基因准种数量≤2的患者相比,F基因准种数量>2的患者血清中,Th1细胞因子IL-12、IFN-y水平降低(P=0.023; P=0.010),Th2细胞因子IL-5. IL-10水平升高(P=0.024；P=0.012)。结论：HCVF基因区准种多样性与病毒复制、肝损伤和机体Th2优势应答有关,具有一定的临床意义。第三部分HLA-DPA1/B1基因多态性对HCV感染慢性化及F蛋白产生的影响目的：探讨HLA-DPA1/B1基因多态性对HCV感染慢性化及HCVF蛋白产生的影响,为HCV个体化治疗提供一定的科学依据。方法：运用Taqman-MGB技术检测702例CHP和342例HC者HLA-DPA1(rs3077)和HLA-DPB1(rs9277534)位点的基因多态性；运用PCR-SSP/SBT法对上述样本HLA-DPA1/B1基因第二外显子进行扩增、测序和等位基因鉴定。结果：多因素Logistic回归分析结果发现rs3077在累计基因模型和显性基因模型中不仅能显著增加HCV感染慢性化的风险(OR值分别为1.32和1.53),而且还可降低HCV F抗体产生的风险(OR值分别为0.56和0.80)；而结果未发现rs9277534各多态性位点的基因型在CHP组与HC组或F抗体阳性组与F抗体阴性组之间的分布差异有统计学意义。随后对单倍型分析发现：HCV感染慢性化的保护单倍型为DPA1*0202-DPB1*0501和DPA1*0202-DPB1*0202,易感单倍型为DPA1*0103-DPB1*0501和DPA1*0103-DPB1*0201。此外,研究同样发现单倍型DPA1*0103-DPB1*0201和DPA1*0202-DPB1*0202与HCV F抗体产生具有一定的相关性。结论：通过本研究,我们第一次报道了HLA-DP基因多态性与HCV感染慢性化及HCV F蛋白产生存在一定的关联性。