【摘 要】
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碱性果胶酶一般是指聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL),已经被广泛应用于纺织工业、造纸工业、韧皮纤维脱胶和污水处理等。本论文在实验室前期研究的基础上,对原始菌株B.subtilis 7-3-
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碱性果胶酶一般是指聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL),已经被广泛应用于纺织工业、造纸工业、韧皮纤维脱胶和污水处理等。本论文在实验室前期研究的基础上,对原始菌株B.subtilis 7-3-3进行基因组测序,并对B.subtilis 7-3-3、B-pN-pelA、B-pN-pelA+pelC进行蛋白质组分析,根据蛋白质组差异表达的结果进行基因工程菌株构建,总结结果如下:(1)基于基因组数据,进行了 CAZyme的注释、蛋白酶注释以及脱胶相关酶注释的汇总,最后发现PL家族蛋白除了 3个果胶酶基因pelA、pelB、pelC以外,还包括yesW(鼠李聚半乳糖醛酸裂解酶),且与脱胶相关;另外发现一些与鼠李半乳糖醛酸酶相关的基因,且以基因簇的形式存在。这些可为高效脱胶菌株的构建提供参考。(2)对不同时间的B.subtilsi 7-3-3发酵液进行质谱分析,发现48 h发酵液蛋白质组检测到的蛋白数目最多,且理论分泌蛋白所占比例最高。根据蛋白质组含量较高的蛋白基因,开展了筛选启动子应用于过表达pelA和pelC基因的工作。分别运用了酶切连接的方式、同源重组的方式、添加pelA自身SD序列的方式构建过表达载体,结果发现采用酶切连接方式中,只有csn基因启动子具有过表达pelA的效果;同源重组的方式使HP1基因过表达pelA的菌株(B-pN-CHPl-A)达到已有菌株B-pN-pelA的PGL酶活水平;添加pelA自身SD序列的方式使csn启动子过表达pelA的菌株(B-pN-Ccsn-2A)PGL酶活达到1331U/mL,为已有菌株B-pN-pelA的1.3倍。而过表达pelC基因时,无论采取何种方式,对PGL酶活都没有明显的提高效果,推测启动子的更换对pelC基因表达影响不大,或者聚半乳糖醛酸并非pelC的最适底物。(3)对B.subtilis 7-3-3、B-pN-pelA、B-pN-pelA-pelC 三株菌 55 h发酵液进行质谱检测,分别对检测到的总蛋白以及理论分泌蛋白进行了差异分析。在发现菌株独有蛋白和菌株间差异表达明显蛋白的基础上,将其编码基因与pelA基因进行共表达,结果显示aprE(蛋白酶)、yesW(鼠李聚半乳糖醛酸裂解酶)、gmuG(甘露糖苷酶)三者对PGL酶活具有提高的效果,且yesW、gmuG二者对脱胶还具有协同作用;aprE的共表达虽然导致发酵液酶谱改变,但是没有影响脱胶相关酶的活性,因此脱胶效果变化不大;yciB(L,D-转肽酶)的共表达对原有蛋白的PGL活力影响不大;spo VR(碱性磷酸酶)与pelA的共表达对PelA蛋白表达具有负作用。
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