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随着恒牙胚的发育,乳牙到一定时期牙根逐渐吸收,导致牙冠脱落,由萌出的恒牙所代替的过程称为乳恒牙替换。此过程是多因素、多细胞参与的复杂又严密的生理过程,目前的研究方向主要为乳牙根吸收和恒牙胚的发育。现已证实,OC与OD是参与吸收乳牙根、牙槽骨等组织的重要功能细胞,并为恒牙胚的发育和萌出创建通道。但其作用机制尚不清楚,因此对OC的深入研究为进一步探讨乳恒牙替换机制有着重要的意义。骨保护素(OPG)是近年来骨代谢研究领域新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体,具有抑制OC形成、分化和增加骨密度等功能,是抑制骨吸收的关键因子。在骨骼,OPG主要由成骨细胞和骨髓基质细胞产生。研究已证实,成骨细胞分泌OPG与其配体OPGL的结合可阻断OC发生的RANKL/RANK信号通路,从而抑制破骨细胞前体细胞的增殖、分化、融合和成熟OC的激活。另外,Hakeda等发现OPG可通过结合OC表面F-肌动蛋白而直接抑制成熟OC的骨吸收活性。目前,国内外文献中未见有OPG表达于OC的报道,而OPG在乳恒牙替换过程中所起作用的研究也未见报道。根据OC来源于造血细胞,由单个核前体细胞融合而成,而文献中OPG高表达于单核细胞,推断OC有可能表达OPG,进行自我调节,抑制其本身的分化。为了探讨OPG在乳恒牙替换期的OC和OD中有无表达,本研究一方面将犬乳恒牙替换过程分为乳牙根稳定期、乳牙根吸收期、恒牙列期三个阶段,采用IHC和ISH的实验方法,分别从蛋白和mRNA水来检测OPG在乳牙牙根、牙槽骨中的OD、OC和恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞中的表达情况,初步探讨了OPG在犬乳恒牙替换过程中可能的作用。另一方面参考了OC体外培养的文献,用淋巴分离液从人外周血细胞中分离出PBMC进行培养,培养液中加入1,25(OH)2 D3、M-CSF、RANKL对12d后出现的OLC采用IHC和ISH实验方法,检测了OPG在体外诱导培养的OLC中的表达情况,并分析了OPG对OLC形成和功能的调节作用。主要研究内容及结果如下:第一部分犬乳恒牙替换期OPG表达的研究1.犬乳牙牙根稳定期:犬乳牙牙根尚未发生生理性根吸收,乳牙根完整,乳牙根周围牙槽骨未见吸收陷窝。恒牙胚处于牙冠发育阶段,恒牙胚牙本质、牙釉质基质开始形成。此时恒牙胚周围牙槽骨处于改建期,可见少量OC位于牙槽骨吸收陷窝内。此期牙槽骨的OC、OB OPG IHC及ISH染色阳性,提示一方面OB分泌OPG,通过结合OPGL负调节OC的分化。另一方面OC可能合成和分泌OPG,通过自我调节,直接参与抑制其自身的分化与成熟,参与犬乳牙根稳定期的骨质改建。恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞OPG IHC及ISH染色也为阳性,推测OPG可能参与恒牙胚的发育过程。2.犬乳牙牙根吸收期:犬乳牙牙根发生生理性吸收,乳牙根面可见多数吸收陷窝,呈蚕食状,陷窝中可见多核OD。牙囊周围及接近牙胚的牙槽骨骨质吸收活跃,陷窝内可见多核OC,恒牙胚冠部牙本质、牙釉质进一步形成和矿化。此时可见OPG在乳牙根吸收面的OD、牙槽骨中的OC、OB IHC染色阳性,其中OC和OB染色灰度值较稳定期显著降低(P<0.05),提示此期OPG蛋白表达增强,以防止牙槽骨和乳牙根的过度吸收;OC/OD、OBISH染色阳性,且OC染色灰度值显著低于稳定期(P<0.05),提示此期OC合成、分泌OPG的功能代偿性增强。恒牙胚的成釉细胞、成牙本质细胞OPG IHC及ISH染色也为阳性,提示OPG参与了恒牙胚的发育。3.犬恒牙列期:乳牙脱落,恒牙萌出。牙槽骨OC和OB OPG IHC及ISH染色弱阳性,染色灰度值均显著增加(P<0.05),提示此期OC和OB OPG合成、分泌量明显减少,牙槽骨处于骨质改建较弱的时期。第二部分体外培养破骨细胞样细胞OPG表达的研究分别采用IHC及ISH方法,观察体外培养OLC OPG表达的情况。用倒置显微镜和HE染色观察,3因子诱导培养PBMC 6d即可见一些细胞体积增大,12d后可见多核细胞形成,其中个别细胞体积巨大,胞核数目3-7个。取原代培养12d后的细胞爬片进行OC特征性染色鉴定,出现抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的多核细胞,并且在与细胞共同培养的骨片上出现吸收陷窝,即为OLC。取所培养的OLC进行OPG IHC及ISH染色,结果均为阳性,证实体外培养人OLC中有OPG蛋白和mRNA的表达。总之,本研究观察到OPG表达于乳恒牙替换过程中的OC和体外培养的OLC中,可能通过间接、直接作用负调节OC和OD的分化和功能,使牙槽骨和乳牙根硬组织吸收处于严密控制之下,防止出现快速吸收的现象。