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2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)在农业生产和医药合成中广泛使用。在使用的过程中,2,4-D及其中间产物2,4-DCP会累积在土壤以及地上水和地下水中,高剂量的摄入2,4-D会刺激人类和低等哺乳动物的胃肠道,对中枢神经系统和肝脏也有损伤。2,4-DCP累积会严重影响水环境,对水生物有毒,对人类的眼睛和皮肤有刺激。寻找高效便捷的污染治理方法是当今研究重点,微生物代谢降解的方法具有作用条件温和,经济节约,不会给环境造成二次污染等优点,是当今研究的热点问题之一。2,4-二氯苯酚羟化酶(tfdB酶)能催化降解2,4-DCP,是2,4-D的生物降解过程的关键酶之一。TfdB-JLU酶是一种新型的tfdB酶,具有催化活性更高,底物谱更广以及适应冷性等特点,相较于其他tfdB酶类,在2,4-D及2,4-DCP的酶法降解的研究中更具优势。但是,tfdB酶催化活性普遍很低,TfdB-JLU酶也还达不到工业生产应用的要求,所以对TfdB-JLU酶的设计改造,提高其催化活性和稳定性具有重要意义。同时,TfdBJLU酶作为一种新发现的tfdB酶,关于蛋白的三维结构和催化机理也需要深入研究。在本研究中,首先基于前期的同源模建和分子模拟以及TfdB-JLU对氯酚和联苯类物质的催化活性和专一性研究的内容,半理性设计改造TfdB-JLU对2,4-DCP的催化活性。优化了TfdB-JLU的酶活力检测方法,丙氨酸扫描和自由能变化确定靶标位点。计算机模拟饱和突变TfdB-JLU的靶标位点并利用结合自由能筛选对2,4-DCP催化活性提高的预想没有实现的原因是靶标位点的氨基酸处于柔性较小的区域,不宜突变。251位甲硫氨酸(M251)是前期研究中预测的底物结合位点入口处氨基酸,本研究验证了将其突变为甘氨酸(TfdB-JLU-M251G)后其对2,4-DCP催化活性提高,M251处于TfdB-JLU结构中柔性较大的区域并且位于分子通道上,TfdB-JLU-M251G使TfdB-JLU结构更稳定且扩大了分子通道。结构决定功能,我们尝试解析TfdB-JLU晶体结构。我们初步筛选了近2000个晶体培养条件,最终找到6个可能适合TfdB-JLU结晶的条件,但是基于TfdBJLU蛋白结构的复杂性,我们没有成功解析TfdB-JLU结晶,还需后续优化。最后,我们初步探究了TfdB-JLU的催化产物,我们通过薄层色谱分析发现催化产物的极性大于2,4-DCP。利用液相色谱可以检测到TfdB-JLU催化反应中底物2,4-DCP的减少,说明TfdB-JLU能够催化2,4-DCP。液质联用分析产物成分时只有在输出的TIC图中能看到3,5-二氯儿茶酚的峰,初步论证了TfdB-JLU催化2,4-DCP的产物成分。综上所述,本论文半理性设计改造TfdB-JLU催化活性并对关键氨基酸的结构性质进一步探究,初探TfdB-JLU的晶体培养条件及催化机制。这些探索为TfdB-JLU的深入研究打下坚实基础,对TfdB-JLU在生物降解2,4-D及2,4-DCP污染中的应用具有重要意义。