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组织工程技术的发展为角膜的修复与重建提供了新的途径,该技术的一个重要方面就是载体材料的制备。角膜修复的载体材料要求具有优异的生物相容性和可控降解性,良好的透光率和合适的力学性能。壳聚糖是一种可降解的天然聚阳离子型生物多糖,具有良好的成膜性,壳聚糖膜具有良好的透光性和力学强度,在角膜组织工程中具有良好的应用前景。明胶是胶原的衍生物,分子中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)生物活性短肽,有利于细胞表面黏附分子识别,具有良好的生物相容性、降解性以及生物活性。透明质酸是一种重要的细胞外基质成分,具有良好的降解性以及生物相容性和安全性,能促进角膜上皮细胞的增殖,对细胞的分化和迁移有重要作用。本研究以壳聚糖为基体,通过与明胶共混、交联等方法制备出透明性良好、降解性能可控、生物相容性优异,且与人眼角膜力学强度相适宜的角膜修复材料;并通过表面固定化改性方法,将明胶和透明质酸分别固定于壳聚糖膜表面,初步探讨表面固定化壳聚糖膜的细胞相容性。
分别采用溶液共混法和碳二亚胺交联法制备壳聚糖-明胶共混膜和壳聚糖-明胶交联膜,考察明胶组分比例对共混膜和交联膜性能的影响。结果表明,随着明胶含量增加,共混膜和交联膜的透光率降低,45%以下明胶含量的共混膜和交联膜的透光率与人角膜接近,400nm波长的透光率均在80%以上,透光率的最大值在95%左右;其湿态拉伸强度在3.8MPa以上,能满足角膜修复对力学强度的要求;明胶含量增加,共混膜和交联膜对水的接触角下降,亲水性改善;共混膜和交联膜的吸水率在87.7%-144.2%之间,且共混膜的吸水率高于交联膜;共混膜和交联膜在溶菌酶中的降解失重率均随时间延长而增大,且共混膜降解速度比交联膜快,降解液的pH值在整个降解过程中均在7.3左右。共混膜和交联膜基本无细胞毒性,人角膜上皮细胞(HCEC)在共混膜和交联膜上粘附、生长较好,增殖良好,明胶含量较高的共混膜和交联膜在细胞的后期增殖中优势较明显。随着明胶含量增加,共混膜和交联膜上的细胞G1期比例降低,S期和G2期比例上升,细胞在材料表面的适应时间缩短,有利于细胞的DNA合成和分裂增殖,并一定程度上抑制了细胞凋亡,30%以上明胶含量的共混膜和交联膜具有良好的细胞相容性。
为了改善壳聚糖膜的亲水性、降解性和细胞相容性而同时保持壳聚糖膜的优良光学性能和力学强度,本研究采用碳二亚胺缩合剂将明胶和透明质酸分别固定于壳聚糖膜表面,ATR-FTIR、XPS和Zeta电位结果表明明胶和透明质酸分别成功固定于壳聚糖表面。固定化改性后,膜的透光率变化不大,改性膜保持了良好的光学性能;改性膜的吸水率略高于壳聚糖膜,与人角膜的含水率相匹配;100s内,明胶固定化壳聚糖膜和透明质酸固定化壳聚糖膜的接触角分别在82.7°-73.4°和75.0°-67.7°之间,接触角下降,亲水性明显改善;固定化改性后,材料的降解速度加快,60d时,两种固定化改性膜的失重率分别为18.7%和20.6%。降解液的pH值维持在7.2-7.4范围,对人体没有明显的刺激性。两种固定化改性膜无细胞毒性;HCEC在其上粘附、生长良好,细胞的后期增殖情况理想;固定化改性膜上的细胞G1期比例下降,S期比例明显增加,较多的细胞进入DNA合成期,且细胞的凋亡率降低,表面固定的明胶和透明质酸一定程度上抑制了细胞的凋亡。两种表面固定化改性壳聚糖膜具有良好的细胞相容性。