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豆科植物和根瘤菌之间的共生系统已经有了广泛的研究,共生关系的建立首先需要一系列的相互识别过程,随即根瘤菌通过侵入线进入植物细胞,伴随着植物形态发育的改变例如皮层细胞的分裂和生长形成一个特化的器官:根瘤。一个成熟的有功能的根瘤中,根瘤菌能固定空气中的氮转化成氨供宿主植物利用,作为交换,植物为根瘤菌提供光合作用产生的碳源和氨基酸。近些年来,以豆科模式植物苜蓿（Medicago truncatula）和百脉根（Lotus japonicus）为研究对象,在宿主植物中鉴定了一系列与共生相关的基因,并初步建立了早期共生信号转导模式图。其中百脉根共生受体SymRK（symbiosis receptor-like kinase）在根瘤共生（root nodule symbiosis（RNS））中有重要功能,能调控根瘤菌的侵入过程,但其调控机制却知之甚少。本室通过SymRK作为诱饵蛋白筛选百脉根AD-cDNA酵母文库得到与之互作的一个有丝分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）命名为SIP2（SymRK interaction protein 2）,SIP2对侵入线和根瘤的形成都有非常重要的作用,首次发现MAPK级联可能参与了共生信号途径,但其分子机理仍不清楚,本论文以此为出发点寻找SIP2靶蛋白并对MAPK级联调控共生信号途径的机制展开研究:1.在已知SIP2能磷酸化拟南芥AtMPK6的基础上,通过核苷酸序列比对百脉根基因组数据库,找到与AtMPK6最为同源的基因,命名为百脉根LjMPK6。通过酵母双杂分析发现SIP2能与LjMPK6特异性相互作用,且这种互作依赖于SIP2的自磷酸化活性。体外磷酸化分析证明LjMPK6是SIP2的磷酸化底物。2.组织特异性和时空表达分析表明LjMPK6在所有检测的组织中都有表达,且表达受根瘤菌和结瘤因子的诱导。启动子表达分析和免疫荧光结果证明随着根瘤菌的侵入,LjMPK6定位由根毛的顶端转变为沿着侵入线、根瘤原基和成熟根瘤的薄壁组织和维管束。3.为了研究LjMPK6的生物学功能,从百脉根LORE1突变体库中筛选的LjMPK6+/-突变株的后代株系中并没有筛选到纯合突变体。进一步通过CRISPR/Cas9系统对LjMPK6基因组序列进行编辑,仍没有获得有效的编辑突变体。因此,通过RNAi技术下调表达LjMPK6进而研究其在共生结瘤中的生物学功能,运用根瘤特异性表达基因LjNAD1的启动子下调表达LjMPK6并筛选出两个独立的T1代稳定转化株系,研究结果表明,沉默LjMPK6的表达后,根瘤密度和根瘤原基数目与对照植株比较显著降低。为了进一步证明LjMPK6在共生结瘤过程中起正调控作用,利用百脉根泛素启动子过量表达LjMPK6,没有获得超量表达的稳定转化植株。因此我们利用玉米泛素启动子超表达LjMPK6并筛选出两个独立的T2代稳定转化株系进行共生表型分析,结果表明结瘤密度、侵入线数目和根瘤原基数目与对照植株比较都显著提高。4.用LjMPK6作为诱饵蛋白筛选百脉根AD-cDNA酵母文库,获得与之相互作用的蛋白LHK1,并通过Y2H和CoIP实验进一步证明了LjMPK6和LHK1的相互作用,且这种相互作用依赖于LHK1 receiver domain的活性。5.利用细胞分类素的一个输出系统cytokinin two-component output sensor（TCS）:GUS,检测LjMPK6对细胞分裂素信号途径的影响。在TCS:GUS稳定转化植株中通过毛根转化超表达LjMPK6,结果表明超表达LjMPK6后GUS活性显著降低。检测能受细胞分裂素诱导表达的乙烯合成酶的表达,结果表明LjMPK6能部分抑制ACS1和ACS2的表达,且这种抑制依赖于细胞分裂素受体LHK1。通过对乙烯含量的测定,超表达LjMPK6稳定转化植株接种根瘤菌后乙烯含量与对照比较显著降低,而LjMPK6 RNAi稳定转化植株接种根瘤菌后乙烯含量与对照比较显著上调。6.体外蛋白竞争结果表明LjMPK6能与LHP1竞争性结合LHK1 receiver domain。体外磷酸化研究进一步证明LjMPK6能部分抑制LHK1对LHP1的磷酸化水平。