志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，是细菌性痢疾（简称菌痢）的病原体。菌痢是全球都存在的一个公共卫生问题，尤其对发展中国家造成重大危害。志贺菌属根据O抗原分为4个群:分别为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌。随着人们对各种抗生素持续广泛的应用，甚至滥用，使志贺菌耐药现象愈发严重，不但影响临床疗效，而且严重增加治疗成本和新药研发成本，并使新药应用于临床的周期缩短。因此，研究志贺菌耐药机制，进而为志贺菌耐药的防治提供科学依据和有效手段，已成为目前的研究热点。　　插入序列(IS)是可以独立存在的遗传单元，是染色体的特殊组成部分，可以从染色体上的一个位置转移到另一个位置，或在不同染色体间跳跃。最近有学者报道，ISEcp1可能与细菌β-内酰胺类抗生素耐药有关。　　目的：　　本课题通过药物诱导、基因测序等手段，比较志贺菌敏感株诱导前后ISEcp1与blaCTX-M的位置关系及blaCTX-M的表达的变化，以阐明ISEcp1诱导转座影响细菌耐药的分子机制。并进一步收集志贺菌株进行ISEcp1、blaCTX-M的分布、头孢菌素耐药情况及二者对应关系的分析，从而对所阐明的机制提供现场佐证。　　方法：　　1.志贺菌的收集、鉴定:从河南、江西收集志贺菌233株，并进行血清、生化鉴定;　　2.药敏试验:用纸片扩散法测定菌株对所研究抗生素药敏纸片的抑菌环，用琼脂稀释法测定菌株的最低抑菌浓度;　　3.头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验:采用改良K-B法筛选临床分离、鉴定的志贺菌敏感株，用琼脂稀释法测定志贺菌敏感株对头孢噻吩的最低抑菌浓度，采用头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验构建志贺菌诱导耐药株;　　4.全基因组测序分析比较志贺菌敏感株诱导前后差异:Solexa全基因组测序，并利用Clustal等生物学软件进行比较、分析;　　5.ISEcp1转座及对blaCTX-M表达的影响:通过PCR、克隆和测序分析比较诱导前后ISEcp1与blaCTX-M的位置关系;并将克隆构建质粒转化入感受态细胞DH5α，K-B琼脂法对不同转化子进行药敏试验及超广谱β-内酰胺酶表型确证试验，同时做RT-PCR，阐明ISEcp1诱导转座后对blaCTX-M的表达的影响;　　6.ISEcp与blaCTX-M的分布及菌株耐药情况:PCR检测所收集志贺菌的ISEcp1与blaCTX-M，K-B实验进行头孢菌素耐药性检测，将耐药情况与所检测目的基因进行对应分析。　　结果：　　1.对志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz进行头孢噻吩次抑菌浓度诱导，最终得到诱导后头孢噻吩MIC为512mg/L，是诱导前出发菌株的32倍。　　2.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz的前后，不但对头孢噻吩的耐药性发生了改变，同时测得诱导后菌株对头孢唑啉、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟均由敏感转变为耐药。　　3.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株使其耐药后，基因组序列发生了改变，不但有SNV，还造成了新的插入和缺失，且诱导前后菌株插入序列的拷贝数发生了变化。　　4.通过比较志贺菌出发敏感株与诱导耐药株的KEGG代谢通路发现诱导耐药株比出发敏感株多一个代谢通路ko00930:Caprolactam degradation，即己内酰胺代谢通路。　　5.志贺菌被头孢噻吩诱导后，ISEcp1转座插入到blaCTX-M上游，且诱导后的志贺菌较诱导前对多种头孢菌素耐药水平显著提高。　　6.成功获得重组质粒pCTX、pISECTX，并将它们与pMD19-T空载体分别转入DH5α感受态细胞，获得DH5α(pCTX)、DH5α(pISECTX)、DH5α(T)转化子。对DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)插入序列测序发现该blaCTX-M基因为blaCTX-M-55，其上游是ISEcp1含-35区和-10区启动子位点。　　7.DH5α(pISECTX)克隆株blaCTX-M基因表达的相对含量显著高于DH5α(pCTX)的相对含量。　　8.DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对下列头孢菌素均从不耐药到耐药，包括头孢噻吩、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松，对头孢吡肟虽没达到耐药水平，但DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对头孢吡肟的最低抑菌浓度提高了32倍。　　9.对DH5α(T)、DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)进行ESBLs表型确证试验，判定只有DH5α(pISECTX)产ESBLs。　　10.233株志贺菌株中，对头孢噻吩、头孢唑啉耐药检出率较高分别为35.2％和28.3％，对头孢呋辛钠耐药检出率为13.7％，对抗生素头孢噻肟的耐药检出率12.9％高于头孢他啶9.0％，对头孢吡肟的耐药检出率最低，为5.2％。共有92株对1种或1种以上头孢菌素产生耐药。志贺菌耐药谱型分析显示，志贺菌对6种头孢菌素的耐药谱型有24种。最常见的头孢菌素耐药谱型是头孢噻吩、头孢唑啉占35.87％。　　11.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率有逐年上升的趋势。同时期，志贺菌ISEcp1和blaCTX-M的携带率也有逐年上升的趋势。　　12.志贺菌中基因标记分布情况:　　1)ISEcp1阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISEcp1阴性组志贺菌。　　2)blaCTX-M阳性组志贺菌对头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于blaCTX-M阴性组志贺菌。　　3)ISECTX片段阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISECTX片段阴性组志贺菌。　　结论：　　1.在持续的小剂量头孢噻吩药物的作用下，志贺菌对头孢菌素类抗生素的敏感性能大大降低，甚至产生严重耐药。　　2.头孢噻吩诱导敏感志贺菌前后基因组序列发生改变，且诱导耐药株比出发敏感株多一个己内酰胺代谢通路，此代谢通路可能与诱导耐药有关。　　3.在外界头孢菌素压力下，ISEcp1可转座插入到blaCTX-M上游，为blaCTX-M表达提供所需要的启动子，使其高表达导致细菌对各种头孢菌素耐药。　　4.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率逐年上升的同时伴有ISEcp1和blaCTX-M的携带率逐年上升。　　5.ISEcp1和blaCTX-M与头孢菌素耐药有关，且若ISEcp1位于blaCTX-M上游头孢菌素耐药检出率较高。