研制一种新型的双启动子DNA疫苗的载体pCMVnir,其携带HCMV前早期启动子CMVie和细菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB,可在原核细胞和真核细胞中表达抗原基因;并以此载体,构建HPVl6双启动子DNA疫苗载体pCMVnir16L1E7,导入减毒沙门氏细菌S.SL3261,可有效表达HPV16 L1E7抗原,口服免疫后可在小鼠体内相关淋巴组织和器官中定植并有限复制达6周,然后被机体清除;分别用pQE-16L1E7在大肠杆菌和rAd5-16L1E7在293细胞中表达的L1E7蛋白和嵌和VLP研究疫苗的效果,疫苗接种后可诱发HPV特异的粘膜免疫,在生殖道分泌物中产生HPV特异的抗体,能中和HPV16 VLP诱导的RBC凝集作用,pCMVnir16L1E7诱导的免疫反应强度要优于对照疫苗组的HPV16疫苗载体pNir-16L1E7、pNir-16L1E7CTA2B和常规DNA疫苗pCMV-16L1E7。与其他疫苗体系相比具有明显的优点,沙门氏细菌可将疫苗直接导入APC细胞中表达,且做为一种天然的免疫佐剂,可促进抗原的递呈;因为其携带原核和真核两种启动子、细菌复制子,可通过增加抗原量、增加机体和细胞内DNA疫苗拷贝数等途经增强DNA疫苗的疗效,同时还可以作为一般的载体用于蛋白质在真核和原核细胞的表达,简单易行,不用添加化学诱导剂和改变培养体系的温度。据文献检索:此类质粒尚属首次报到。 新型双启动子DNA疫苗载体pCMVnir(pCN)的构建及启动子活性分析:DNA疫苗是一种以DNA重组技术构建的携带抗原基因的真核表达质粒,经肌肉和皮内免疫可诱导机体产生相应的免疫应答,因其有制备工艺简单、易于保存和应用等优点,但目前DNA疫苗诱导的免疫反应强度难以达到预期要求,增强DNA疫苗的免疫原性和诱导保护性免疫的强度成为重点研究的问题,由于胞内寄生菌可直接进入抗原递呈细胞,是一种天然的粘膜免疫佐剂并是抗原表达和DNA疫苗复制的场所而成为DNA疫苗的携带工具;但目前所有的DNA疫苗表达载体均为真核细胞表达质粒,难以在细菌中表达抗原。为适应以细胞内寄生细菌为载体的DNA疫苗的研究趋势,我们采用CMV ie和细菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB构建双启动子载体pCMVnir,或称为pCN,其中HCMV ie启动子是目前应用广泛和十分理想的真核启动子;而原核细胞启动子是决定疫苗稳定性和诱导细胞免疫的关键因素,我们