乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。据报道,我国乳腺癌发病率和年新发病例呈逐年上升趋势。尽管随着早期筛查的开展和综合治疗手段的提高,全球乳腺癌死亡率呈逐渐下降趋势,但中国乳腺癌死亡率在一些发达地区却呈现上升趋势,严重威胁女性健康。淋巴结与血管转移是导致乳腺癌患者预后不良的主要原因,约30%以上的患者死于复发和转移。因此,深入研究乳腺癌如何复发和导致转移的机制,寻找导致乳腺癌复发转移的分子标志物和干预靶点是目前认为最有效监控、预防和控制乳腺癌复发的手段,对提高乳腺癌的整体治疗水平具有极其重要的临床意义。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类因为序列中缺少开放阅读框,而不具有或很少具有蛋白质编码功能的非编码RNA,转录长度超过200nt,通常具有polyA尾巴和启动子结构。既往研究发现多种lncRNA可以通过表观修饰、转录及转录后水平调节、翻译水平调节等多种途径调控肿瘤侵袭转移的过程,影响肿瘤细胞增殖、血管形成等生物学过程,在恶性肿瘤癌的发生发展过程中起重要作用。既往在进行lncRNA差异性筛选时,多采用原发灶和正常组织进行分析。但由于与恶性肿瘤原发灶相比,转移灶中多种lncRNA的含量往往发生显著改变,且表达水平的改变往往与肿瘤侵袭转移及患者预后密切相关。因此为寻找导致乳腺癌复发转移的分子标志物和干预靶点,本研究主要在乳腺癌原发灶和转移灶中进行lncRNA基因芯片差异筛选。本研究拟从乳腺癌的IncRNA表达谱入手,分析lncRNA在乳腺癌及其转移淋巴结组织中的差异表达。为了探索lncRNA在乳腺癌细胞的表达、分子生物学作用及其对肿瘤的调控的初步机制,本课题进行了两部分的研究。第一部分:乳腺癌及其转移淋巴结组织中差异lncRNA的筛选验证;第二部分:抑制lncRNA00499表达对乳腺癌肿瘤生物学功能影响的体内外研究及机制初探。第一部分乳腺癌及其转移淋巴结组织中差异lncRNA的筛选验证目的:为探讨乳腺癌的发病机制,本研究应用微阵列芯片技术观察lncRNA在乳腺癌组织中的表达谱,分析lncRNA在乳腺癌及其转移淋巴结组织中的差异表达,并在细胞和组织水平验证芯片结果,最后分析筛选出来lncRNA与临床病理参数及预后的相关性。方法:1.收集标本,包括59例乳腺癌组织及相对应的转移淋巴结组织标本,以及183例临床病理及随访资料完整的乳腺癌标本。2.采用lncRNA芯片检测5例乳腺癌组织及其相对应的转移淋巴结组织标本中lncRNA表达情况,分析差异化表达的lncRNA。3.运用qRT-PCR检测54例样本中lncRNA00499表达水平,分析其表达水平与乳腺癌患者临床病理资料相关性。4.运用qRT-PCR检测183例样本中lncRNA00499表达水平,分析其表达水平与乳腺癌患者预后资料的相关性。结果:1.乳腺癌组织和相对应的转移淋巴结组织中筛选得到198个差异表达的lncRNA,其中在转移淋巴结组织中上调的lncRNA有45个(22.7%),下调的lncRNA有153个(77.3%)。2.lncRNA00499在乳腺癌转移淋巴结组织和乳腺癌高侵袭转移细胞株中异常高表达(P<0.05),lncRNA基因芯片结果和qRT-PCR的结果保存一致,说明芯片结果的可靠性。3.乳腺癌组织中lncRNA00499在癌组织中的表达水平与患者肿瘤的TNM分期有关(P<0.05),与病人的年龄、体重指数、月经状态、家族史、肿瘤的大小、淋巴结转移情况、分化程度、脉管侵犯、激素受体状态、HER2基因表达、Ki67表达无相关性(P>0.05)。4.lncRNA00499表达与乳腺癌患者预后密切相关,lncRNA00499高表达患者5年总生存率具有高于低表达患者的趋势(p=0.057),尤其在luminal型乳腺癌患者差异显著(P<0.05)。结论:乳腺癌组织及其相对应的转移淋巴结组织标本lncRNA表达谱差异显著。lncRNA00499是乳腺癌中潜在的非编码致癌基因,可以作为判断乳腺癌预后的独立指标,但其功能和作用机制仍有待进一步深入研究。第二部分抑制lnc RNA00499表达对乳腺癌肿瘤生物学功能影响的体内外研究及机制初探目的:应用RNA干扰技术,抑制lnc RNA00499在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达,体内外实验分析lnc RNA00499对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移能力的影响,并二代测序分析相关信号通路,为以lnc RNA00499为靶点的乳腺癌治疗提供实验依据。方法:1.制备和包装沉默lnc RNA00499表达的重组慢病毒,感染对数期生长乳腺癌细胞系MDA-MB-231,建立下调lnc RNA00499表达的乳腺癌细胞株。2.设立两组:实验组(lnc RNA00499慢病毒感染组)和Ctrl组(lnc RNA无关序列对照组)3.Incu Cyte活细胞成像系统、平板克隆形成实验检测各组细胞增殖和生长能力。4.Transwell小室实验、划痕实验检测各组细胞侵袭迁移能力。5.荷瘤小鼠实验检测体内水平沉默lnc RNA00499的表达对乳腺癌的影响。6.二代测序检测lnc RNA00499沉默表达对乳腺癌细胞lnc RNA/m RNA表达谱的影响。结果:1.成功制备了重组慢病毒lnc RNA00499(Sh)和Ctrl组,对比Ctrl组,Sh-2,Sh-3组下调lnc RNA00499表达的效率分别为86.5%和84.5%(P<0.0 5)。2.Incu Cyte活细胞成像系统检测结果显示在MDA-MB-231细胞中,重组lnc RNA00499 sh RNA组(sh-499)与sh Ctrl组相比在12h的吸光度显著减少,且随着时间的持续,差异越来越大,差异具有统计学意义(P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示在MDA-MB-231细胞中,重组lnc RNA00499 sh RNA慢病毒感染14天后,sh组与Ctrl组相比胞克隆形成数明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Transwell小室实验结果显示重组lnc RNA00499 sh RNA组(sh-499)与sh Ctrl组相比,穿膜细胞数明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕实验显示在MDA-MB-231细胞中,重组lnc RNA00499 sh RNA组(sh-499)与sh Ctrl组相比,划痕48h后划痕愈合速度明显下降。差异有统计学意义(P<0.05)。4.裸鼠移植瘤体内实验结果显示对比对照组,lnc RNA00499 sh RNA组裸鼠移植瘤显著减小,有统计学意义(P<0.05)5.二代测序结果显示lnc RNA00499沉默表达的乳腺癌细胞与对照组相比,共筛选出604个表达上调的转录本,363个表达下调的转录本,Pathway分析结果显示,lnc RNA00499沉默表达的乳腺癌细胞显著改变的信号通路中除了肿瘤相关的信号通路,还有涉及肿瘤转移相关的信号通路:如Regulation of actin cytoskeleton;涉及肿瘤增殖相关的信号通路,如TGF-beta signaling pathway,Hippo signaling pathway,Hedgehog signaling pathway。结论:lnc RNA00499参与乳腺癌细胞增殖和迁移。二代测序显示lnc RNA00499与乳腺癌细胞增殖和转移信号通路密切相关,沉默lnc RNA00499基因有望应用于乳腺癌的靶向治疗和预后判断。