背景和目的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑内最常见的恶性肿瘤,治疗效果不佳,预后差。GBM血管极为丰富,抗血管生成治疗主要用于复发性GBM,也有研究用于首次确诊GBM的治疗,能够短期有效,使肿瘤停止生长或缩小,延长部分病人生存时间。但是,往往在数周或数月内肿瘤失去对药物的反应而继续生长,且恶性程度增大。此时肿瘤的血管特征主要为管腔增大、不规则、内含多层分隔和多管腔,符合肾小球样微血管的形态特征。最近研究发现GBM内一部分干细胞样胶质瘤细胞可转分化为血管内皮细胞,参与肿瘤血管壁的形成,此血管形成方式被认为是目前抗血管生成治疗失败的原因之一。另一方面,相对于经典出芽血管,结构功能高度异常的肾小球样微血管形成与GBM患者无进展和总生存期显示出更强的负相关,抗血管生成治疗失败、复发多见于以肾小球样微血管为特征的GBM。前期研究发现,组织因子(Tissue factor,TF)在肿瘤内表达分布区域与肾小球样微血管分布区域一致。因此,我们认为TF可能在GBM肾小球样微血管形成起重要作用。以上发现将为抗血管生成治疗抵抗的机制研究提供新思路。因此,寻找针对抗血管生成治疗的新方法和相应的影像学表现成为当今研究的重点。为验证上述假设,本实验将从GBM肿瘤微血管内皮构成和分子调控作用到特殊的肾小球样微血管结构的形成进行系列研究,从肿瘤血管形成的微观层面到宏观层面进一步揭示GBM肿瘤微血管形成机制。第一部分,以GBM临床标本、大鼠C6原位胶质瘤组织以及胶质瘤细胞为研究模型,明确GBM肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究。第二部分,以56例GBM患者为研究对象,并以裸鼠U87原位胶质瘤组织及胶质瘤细胞为研究模型,探讨GBM肾小球样微血管形成机制及其与MRI相关性研究。第三部分,针对以上GBM肿瘤微血管形成机制,对其进行靶向标记与治疗,并用MRI评价。本研究将为GBM有效抗血管生成治疗靶点筛选、靶向治疗、病程演变监测、疗效评估提供实验依据。材料和方法本研究由细胞实验、动物实验、临床实验三部分组成。细胞实验以U87人源性胶质瘤细胞系、C6大鼠源性胶质瘤细胞系、人脐静脉内皮细胞系和培养的大鼠脾脏来源的EPCs为研究对象。动物实验采用裸鼠和SD大鼠原位脑胶质母细胞瘤模型。临床实验以原发GBM患者为研究对象。一、胶质母细胞瘤肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究1.临床GBM肿瘤标本、C6胶质瘤原位模型肿瘤组织冰冻切片,CD34、CD31、v WF免疫荧光染色检测肿瘤内血管内皮细胞CD34、CD31、v WF与GFP共同表达情况。2.将携带GFP的表达慢病毒质粒转染入C6胶质瘤细胞,并检测转染率。3.体外低氧环境培养C6胶质瘤细胞,CD34、CD31、v WF免疫荧光染色检测肿瘤内血管内皮细胞CD34、CD31、v WF与GFP共同表达情况。4.用DAPT、sunitinib和常氧环境刺激肿瘤细胞,流式细胞术检测刺激对肿瘤细胞转分化率的影响,体外成血管检测刺激对肿瘤细胞转分化为内皮细胞功能影响。5.免疫蛋白印迹检测肿瘤细胞和肿瘤组织内HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1蛋白表达情况。6.密度梯度离心法从SD大鼠脾脏组织中获取单个核细胞,每隔3天换一次培养基,根据在培养过程中细胞形态学、双吞实验、体外成血管实验鉴定贴壁细胞是否为EPCs。7.用USPIO标记EPCs,经尾静脉注射入荷瘤鼠体内,用MRI T2加权成像、T2 map、SWI观察EPCs在肿瘤内数量、分布和与血管的关系。8.普鲁士蓝染色观察标记的EPCs在瘤内的分布情况,流式细胞术评估归巢至胶质瘤中的外源性EPCs的含量。二、胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其与MRI相关性研究1.纳入56例GBM患者,收集患者肿瘤组织石蜡切片,CD34、GFAP免疫组化染色检测GBM组织内部分肿瘤血管内皮细胞CD34、GFAP共同表达情况,以及肿瘤微血管密度、面积、管径情况。TF、VEGF、HB-EGF免疫组化染色检测GBM组织TF、VEGF、HB-EGF蛋白表达情况。2.用免疫蛋白印迹和免疫荧光染色检测TF在U87胶质瘤细胞的表达和分布。3.用RNA干扰敲减U87胶质瘤细胞内TF的表达并检测敲减效率。4.建立裸鼠原位GBM模型,免疫组化检测瘤内TF表达区域与GBM抗血管生成治疗抵抗后形成的血管分布区域的相关性。5.肿瘤细胞相关实验分四组:对照组、TF9-10H10(TF抑制剂)干预组、空病毒组、TF敲减组,MTT法检测TF对U87胶质瘤细胞增殖能力的影响,划痕实验和transwell检测TF对U87胶质瘤细胞迁移能力的影响,流式分析TF对U87胶质瘤细胞凋亡的影响。6.收集内皮细胞条件培养基(Conditioned medium,CM),包括U87-CM、EV-CM和TF sh RNA-CM三组。用条件培养基刺激内皮细胞,检测各组CM(TF含量不同)对内皮细胞增殖、侵袭、体外成血管以及PAR2、HB-EGF蛋白表达的影响。7.纳入的GBM患者术前行常规MRI、MRI灌注成像(包括DCE-MRI和VSI-MRI)检测。8.GBM患者MRI表现、DCE-MRI和VSI-MRI相关参数值和GBM组织内TF表达、微血管形成情况的相关性分析。三、胶质母细胞瘤肿瘤微血管靶向标记与治疗及MRI评价1.免疫荧光染色和透射电镜观察外源性EPCs是否整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的肿瘤血管。2.免疫蛋白印迹检测肿瘤细胞和肿瘤组织内HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1蛋白表达情况。3.移植EPCs荷瘤鼠分两组:对照组、BBG干预组。MRI检测两组肿瘤大小、血供、标记的EPCs归巢至肿瘤的分布和数量,免疫荧光检测调控P2X7受体对EPCs整合至含肿瘤细胞-内皮转分化血管的影响。4.TF实验动物模型分四组:对照组、空病毒组、TF敲减组、贝伐单抗干预组,建立裸鼠原位GBM模型。5.采用Kaplan-Meier分析法对四组动物模型进行生存分析,并检测各组是否存在显著性差异。6.MRI常规扫描监测各组动物模型在不同时间点肿瘤体积和侵袭情况的变化;MRI灌注扫描监测肿瘤血流灌注情况的变化。7.H&E染色观察各组动物模型肿瘤侵袭情况。CD34免疫组化染色检测各组GBM组织微血管密度、面积、管径情况。8.免疫组化染色和免疫蛋白印迹检测各组动物模型肿瘤组织内TF、VEGF、HB-EGF蛋白表达情况。结果一、胶质母细胞瘤肿瘤血管内皮构成及其MRI示踪研究1.GBM肿瘤微血管肿瘤细胞-内皮转分化及其调节通过胶质瘤组织免疫组化及免疫荧光染色,发现肿瘤组织内部分微血管内皮细胞不仅表达内皮细胞标记物,还表达肿瘤细胞标记物,此种内皮细胞来源于肿瘤细胞转分化。同时,体外实验发现胶质瘤细胞能转分化为内皮细胞,并具有内皮细胞的功能。通过肿瘤组织和肿瘤细胞的免疫蛋白印迹发现,转分化率高的肿瘤/转分化诱导的肿瘤细胞HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1表达量明显高于转分化率低的肿瘤/对照组。用DAPT、sunitinib和常氧环境干预肿瘤细胞转分化为内皮细胞实验,发现肿瘤细胞转分化率明显降低。2.外源性EPCs归巢整合至肿瘤血管与MRI活体示踪通过MRI T2加权成像(T2WI)、T2 map示踪和定量标记USPIO的外源性EPCs归巢至肿瘤,早期分布于肿瘤边缘,后逐渐分布于整个肿瘤。磁敏感加权成像显示标记的EPCs归巢至肿瘤血管。普鲁士蓝染色、免疫荧光染色及流式细胞术分析证实了MRI的发现,外源性EPCs可归巢整合至肿瘤血管,参与肿瘤血管内皮构成。二、胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其与MRI相关性研究1.GBM肾小球样微血管与肿瘤内TF表达的关系和临床意义通过对56例GBM患者肿瘤组织免疫组化染色发现GBM肿瘤组织内TF表达量与肿瘤恶性程度成明显正相关。TF表达区域与肾小球样微血管分布区域相似,VEGF表达区域与血管芽生的分布区域相似。进一步分析发现肿瘤内TF表达与肾小球样微血管面积呈明显正相关,而VEGF表达与血管芽生的微血管密度呈明显正相关。2.TF介导的GBM肾小球样微血管形成的分子特征通过肿瘤组织的免疫组化和免疫蛋白印迹发现抑制TF表达可降低PAR2和HB-EGF的表达。条件培养基刺激内皮细胞发现TF可通过独立于VEGF的PAR2/HB-EGF信号通路调节内皮细胞的增殖、迁移、成血管能力。另一方面,通过体内MRI、病理分析和体外细胞侵袭实验发现TF可通过调控肿瘤细胞的侵袭能力来调节肾小球样微血管的形成。3.MRI活体评估GBM患者肿瘤内TF表达及肾小球样微血管肿瘤内分布情况通过对GBM患者术前行MRI解剖和功能成像与患者肿瘤组织内TF表达和微血管含量关联分析,发现瘤内TF表达水平高的GBM,Ktrans map显示肿瘤区域的血管通透性高,VSI map显示肿瘤血管管径较大,高通透性、大管径血管符合肾小球样微血管的特征。进一步分析发现Ktrans热点值和VSI热点值与GBM肿瘤组织内TF表达含量成明显的正相关。因此,MRI灌注成像的Ktrans热点值和VSI热点值可作为评估GBM患者肿瘤内TF表达和肾小球样微血管含量及分布的影像学标记物。三、胶质母细胞瘤肿瘤微血管靶向标记与治疗及MRI评价1.胶质母细胞微血管肿瘤细胞转分化的靶向诊疗载体及其调控通过免疫荧光染色和透射电镜显示外源性EPCs归巢整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的血管。并且,肿瘤细胞转分化率和HIF-1α、Notch 1、Flk1和p-Flk1表达水平在EPCs移植组/EPCs条件培养基干预组与对照组无显著差异。因此,EPCs可作为靶向载体,携带药物靶向治疗肿瘤细胞-内皮转分化。通过MRI T2WI、T2 map发现BBG(P2X7受体抑制剂)可抑制EPCs归巢至肿瘤,普鲁士蓝染色及流式细胞术证实了MRI的发现。磁敏感加权成像、免疫荧光染色和透射电镜显示BBG降低归巢整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化血管的EPCs数量。因此,通过P2X7受体调控外源性EPCs整合至含有肿瘤细胞-内皮转分化的血管,以提高靶向示踪及治疗的效率。2.靶向抑制组织因子治疗胶质母细胞瘤肾小球样微血管形成及其MRI评价通过MRI T2WI显示TF敲减组的肿瘤体积和肿瘤侵袭面积明显减低,DCE-MRI灌注成像显示TF敲减组的肿瘤Ktrans值明显降低,SWI成像显示TF敲减组的肿瘤内低信号明显减少,以肿瘤周边较为明显。同时,免疫组化分析发现TF敲减组的肿瘤内微血管密度、面积、管径较对照组均显著降低,减低瘤内肾小球样血管形成。贝伐单抗组的肿瘤内微血管密度较对照组均显著降低,但微血管面积未见明显变化,管径增大,减低经典的血管芽生的形成。因此,靶向抑制TF在GBM肿瘤内的表达可显著抑制肿瘤生长和肾小球样微血管形成,并延长荷瘤鼠的生存时间。结论1.本实验揭示GBM肿瘤微血管形成可能涉及的两种机制:1)GBM肿瘤细胞-内皮转分化参与肿瘤微血管内皮构成;2)TF通过调控独立于VEGF的PAR2/HB-EGF信号通路促进内皮细胞增殖以及增加肿瘤细胞的侵袭能力,从而促进肾小球样微血管形成。2.外源性USPIO标记的EPCs可作为GBM微血管肿瘤细胞-内皮转分化的MRI靶向诊疗载体,P2X7受体调控可提高其靶向示踪及治疗的效率。3.靶向抑制TF治疗GBM能有效抑制肾小球样微血管形成,延长荷瘤鼠生存时间,同时MRI能有效的评价靶向抑制TF的治疗效果。Ktrans热点值和VSI热点值可作为活体评估肿瘤内TF表达和肾小球样微血管含量及分布的MRI影像学标记。这将为GBM抗血管生成新型治疗靶点筛选、病程演变监测和疗效评估等提供实验依据。