[背景／目的]乙肝病毒相关性肾小球肾炎(HBV-GN)是HBV感染主要的肝外表现之一,免疫复合物引起的肾组织损伤是HBV-GN目前较为公认的发病机制。而现今免疫电镜对HBV-GN肾组织的超微形态结构观察发现肾固有细胞内HBV的存在,以及PT-PCR检测技术在HBV-GN’肾组织内直接检测到HBV-DNA的复制,均提示除HBV抗原-抗体复合物在肾小球沉积等经典免疫复合物致病途径外,还应该考虑HBV直接感染所致的组织损伤可能也参与了发病。据此有学者提出“HBV可在肾组织直接感染、复制及损伤”的观点。虽有上述研究和证据支持这一观点,却都仅为形态学观察结果或分析推论,少有在分子水平阐明病毒的直接损伤机制的相关研究,因此仍需深入探讨,以揭示HBV病毒本身在疾病发生的分子作用通路。胞浆内DNA是机体发生免疫应答的一个强力激发因子,免疫反应过程中所涉及的下游信号通道已被广泛研究和揭示,但是机体对细胞浆内的外源性DNA的识别和触发机制知之甚少。近年来免疫学基础研究发现：PYHIN蛋白成员--IFI16和AIM2是细胞内的双链DNA感受器,IFI16能够感受胞质和核内dsDNA,发起天然免疫应答,通过不同信号通路最终诱导产生IFN-β参与炎症反应；AIM2可感知转染到胞质中的外源性dsDNA并与其结合,通过其特殊结构域使Caspas-1的活化,形成炎性复合体,参与炎症反应。不同研究证明,细胞感染病毒后,细胞内的外源性dsDNA会激活AIM2并使之持续表达,成为一个重要的炎症反应物并触发一系列胞内反应,分泌和释放IL-18、IL-1β,进而发挥致炎和致凋亡等多种重要的生物学活性。其中由TLR4介导的信号通路中MyD88依赖性途径,通过TIR区域向胞内传递信号,激活JNK和NF-κB等因子,引起[L家族蛋白及I FN的释放这一下游信号通路已被多项研究证实。近年来陆续可见关于PYHIN家族蛋白及细胞内DNA感受器的研究报道,但均局限于免疫学基础研究及肿瘤病因学研究,在感染性疾病中的研究报道则主要集中在细菌感染方面,少量关于HBV与AIM2的研究主要为基础研究,未见PYHIN家族蛋白在HBV感染性疾病中的研究和探讨。HBV是双链DNA病毒,基于在HBV-GN肾组织肾小球固有细胞内中已经明确发现HBV-GN存在及其复制,结合细胞内IFI16和AIM2相关研究取得的上述进展,本研究设定IFI16. AIM2为研究目标,将其能够感知细胞内dsDNA后发生一系列致炎作用这一特性应用于HBV-GN的发病机制的研究中,探讨HBV病毒DNA在肾组织中是否激活细胞内IFI16、AIM2,及其活化后在HBV-GN这一临床疾病中的具体致病机制。同时明确作用受体,使IFI16、AIM2炎性复合体成为治疗HBV-GN等病毒等感染性疾病的一个可能的目标,为疾病的临床治疗和药物的开发设计提供新的思路。[方法]本研究运用组织学实验结合体外细胞学实验两条路线进行,相互印证。应用肾穿刺组织活检常规病理技术(包括HE染色及特殊染色)、免疫荧光染色、免疫组织化学染色及电镜技术,结合临床检查明确HBV-GN诊断,同时应用电子显微镜技术筛选肾组织内存在HBV病毒颗粒的HBV-GN病例入组(实验组：45例),以原发性膜性肾病病例为对照组。应用免疫组化染色检测组织内IFI16、IFN-β、 AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达情况,明确肾组织内HBV感染与IFI16、AIM2的表达之间的相关性,明确IFI16的激活与IFN-β的表达情况、AIM2的激活与Caspase-1的表达及其下游因子IL-1β、IL-18的表达情况的相关性,及IFU16和AIM2表达之间的相关性。将肾小球固有细胞(包括内皮细胞HREC、系膜细胞HRMC.足细胞HRPC)进行体外培养,经pcDNA3.0-1.1HBV转染后,分别进行PT-PCR检测及Western Blot检测,定位及定量测定受HBV感染的肾小球固有细胞胞浆中各项指标(IFI16、AIM2、IFN-β、Caspase-1、IL-1β和IL-18) mRNA及蛋白产物的表达水平,与非转染组对照,分析相关性,探讨HBV-DNA在触发IFI16、AIM2的激活与表达后,IFI16与IFN-β、AIM2与Caspase-1激活之间的关系,炎性复合体的形成,以及与下游炎症因子IL-1β、IL-18分泌与释放之间的相关性。细胞实验中,分别构建工FI16和AIM2的siRNA沉默基因,设立siRNA与HBV共转染组,在同样存在HBV感染条件下重复测定各系细胞内IFI16、IFN-β、AIM2、 Caspase-1以及下游因子的含量,分析两两之间相关性,在同一实验路线中双向进行验证,明确HBV-DNA激活IFI16、AIM2是病毒直接损伤作用的关键触发因素,炎性复合体形成并导致炎性损伤在HBV-GN发病中发挥重要作用。两条路线相互印证,互为补充。[结果]电镜检测在19.07%HBV-GN患者肾组织内发现HBV病毒样颗粒,明确了HBV在肝外肾组织内的沉积。另外发现少数组织学检查HBsAg、HBcAg均为阴性、按照诊断标准无法诊断为HBV-GN的HBV患者,在肾组织内查到病毒样颗粒,这种情况下电镜检查可以作为补充手段补足诊断依据,修正补充光镜诊断,减少漏诊或误诊。HBV-GN临床表现复杂,最常出现的肾损害表现为蛋白尿,其次为血尿合并蛋白尿或肾病综合症。病理形态学表现多种多样,以膜性肾病、膜性肾病伴非典型性改变及膜增生性肾小球肾炎改变最为多见；平均发病年龄：36.5±12.5岁；男性多于女性。HBV-GN组肾组织中IFI16、AIM2的表达显著高于原发性膜性肾病组(对照组),说明IFI16和AIM2的激活与HBV感染关系密切。其中IFI16的表达强度与IFN-β的表达强度呈正相关,AIM2表达强度与Caspase-1的表达强度呈正相关,IL-1β、IL-18的表达强度与Caspase-1的表达强度呈正相关。三系细胞中IFI16、IFN-β、AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白水平的检测结果显示：与对照组相比,pcDNA3-3HBV转染组IFI16、IFN-β、 AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平和蛋白表达量均明显增加,其中IFI16的表达强度与IFN-β的表达强度呈显著正相关,AIM2的表达与Caspase-1、 IL-1β、IL-18的表达密切相关；siRNA和HBV共转染组与单纯HBV转染组相比,所有检测指标均明显降低,其中沉默IFI16基因可使IFN-β表达量明显下降；沉默AIM2基因后,Caspase-1, IL-1β,IL-18表达量明显下降。RT-PCR及Western blot检测结果一致。HBV-GN肾组织免疫组化实验结果与体外细胞实验结果一致。[结论]HBV-GN中,PYHIN家族成员中的两个蛋白--IFI16、A1M2为细胞内外源性DNA感受器,可感知胞内HBV DNA,与外源性dsDNA结合导致二者活化后,通过不同作用通路参与了HBV-GN的发生：1.IF116激活后主要通过诱导产生致炎因子IFN-β;2.AIM2激活后活化Caspase-1并与其结合形成炎性复合体,释放致炎因子IL-1β, IL-18。研究证实除经典免疫复合物损伤途径外,HBV在肾组织内的感染及复制,经细胞内DNA感受器识别后激活机体固有免疫反应,导致组织损伤。