研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatis B virus,HBV)流行有地区性差异,我国属于HBV高度流行区,HBsAg(hepatitis B surface antigen)携带率有7.18%,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者大约有2000万。我国的慢性乙型肝炎患者大多数是在围产期或婴幼儿期感染,由于感染时机体免疫系统发育不完善,易导致慢性化。慢性HBV感染的自然史一般可分为三个阶段：免疫耐受阶段、免疫清除阶段、非活动或低复制阶段。抗病毒是治疗慢性乙型肝炎的关键,主要有干扰素和核苷(酸)类似物两种药物。干扰素具有免疫调节和抗病毒的双重作用,是治疗CHB的一线药物。临床上目前应用的主要有长效干扰素,即聚乙二醇化干扰素(pegylated interferon, PEG-IFN)和短效干扰素,即普通干扰素(Standard interferon,IFN). HBV的血清标志物主要包括HBsAg.抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc。五种血清标志物中不同的组合代表不同的状态,并为临床诊断与治疗评价提供依据。对于1、3、5阳性(俗称“大三阳”)的患者,最重要的治疗目标为HBeAg血清学转换,即HBeAg消失,抗-HBe出现。但是我们在观察聚乙二醇化干扰素和普通干扰素的疗效时发现了一种HBeAg/抗-HBe同时阳性的特殊现象,甚至有些患者能持续数月。HBeAg阳性患者在接受干扰素抗病毒治疗时,大多数患者先是血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)下降至正常水平,接着HBV DNA水平下降至阴性或检测不到,最后HBeAg滴度下降直至发生HBeAg血清学转换。然而在这个过程中,有一部分患者会出现HBeAg/抗-HBe同时阳性的现象,多发生在HBeAg滴度很低,并接近其截断值(cutoff value)时。HBeAg是由HBV的4个开放阅读框中的C基因编码的,其滴度受多种因素的影响,其中最重要的是BCP区和前C区的变异。基本核心启动子(basic core promoter, BCP)中T1762/A1764变异,使mRNA转录水平下降,从而降低HBeAg的合成。前C区A1896突变使前C第28位密码子由TGG突变为终止密码子TAG,导致HBeAg前体翻译提前终止。有研究表明前C/C区的变异大多发生于HBeAg血清转换过程前后。HBeAg/抗-HBe双阳性这一特殊现象不仅仅存在于干扰素治疗过程中,在口服核苷(酸)类似物治疗的患者、未进行治疗或者在免疫清除期的患者中也能常常看到,但是目前对于这种特殊现象的临床分析和机制的探索较少。研究目的：1、HBeAg/抗-HBe双阳性的发现及其临床特征—干扰素治疗过程中发现的特殊现象2、比较不同情况下产生HBeAg/抗-HBe双阳性的临床特征3、探讨HBeAg/抗-HBe双阳性的可能机制研究方法：1、收集2007年3月至2010年11月在广州南方医院感染内科门诊或住院并开始使用干扰素治疗的423例CHB患者(包括HBeAg阳性317例,HBeAg阴性106例)的人口学信息、临床和实验室资料,观察比较聚乙二醇化干扰素和普通干扰素的疗效和临床特点。病例纳入标准：①乙型肝炎或HBsAg阳性超过6个月；②治疗前ALT水平间断或持续异常；③近半年内未使用过抗病毒药物和免疫调节剂治疗；④干扰素至少治疗24周。病例排除标准：①治疗期间联合使用抗病毒口服药；②治疗期间聚乙二醇化干扰素与普通干扰素交替使用；③合并其他病毒感染(如：甲型、丙型、丁型肝炎病毒感染或人类免疫缺陷病毒感染),其他原因导致的肝炎(酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物损害性肝病等)：④有干扰素使用禁忌症。2、在干扰素治疗过程中发现HBeAg/抗-HBe双阳性现象后,对出现HBeAg/抗-HBe双阳性的现象的这部分患者进行了临床分析。主要的研究对象为：上述的317例HBeAg阳性患者。按照是否发生HBeAg/抗-HBe双阳性分为两组：即发生过HBeAg/抗-HBe双阳性的患者为研究组,共80例：未发生过双阳性的为对照组,共237例。比较研究组和对照组的临床特征。3、为了解不同情况下的HBeAg/抗-HBe双阳性患者的临床特征是否有不同,我们收集2010年至2012年南方医院感染内科实验室雅培Arthitect i2000检测结果中出现HBeAg/抗HBe双阳性的患者418例,并收集其发生HBeAg/抗-HBe双阳性现象时的资料及部分血清标本。将这些患者分为干扰素组、核苷(酸)类似物组和自发组,比较这三组中双阳性患者的临床特征。使用国产ELISA试剂盒检测部分双阳性血清样本,观察双阳性检测率。4、为了探索干扰素诱导产生HBeAg/抗-HBe双阳性的可能机制,我们从上述病例研究组的80例患者中选取20例,分别为：后来发生HBeAg血清学转换的患者10例,未发生HBeAg血清学转换的患者10例。从本实验室标本库中找出基线、双阳性时、转归后三个时间点的血清标本。通过抽提HBV DNA,巢式PCR及直接测序,用MEGA5.0软件比对分析HBV的基因型,BCP区、前C/C区核苷酸突变和C区氨基酸变异情况。5、收集HBeAg/抗-HBe双阳性血清和抗-HBe单阳性血清,用尿素洗脱法检测并比较两组血清中抗-HBe的相对亲和力指数。研究结果：1、423例干扰素治疗的患者中,治疗前PEG-IFN组与IFN组总体HBV DNA平均水平为(6.1±1.5) log10copies/ml vs.(6.3±1.4) log10copies/ml,差异无统计学意义(P=0.274)。治疗12、24、48周后,PEG-IFN组总体血清HBV DNA水平明显低于IFN组：12周(4.2±1.4) log10copies/ml vs.(4.6±1.5)log10copies/ml,P=0.022;24周(3.8±1.3)log10copies/ml vs.(4.1±1.5)log10copies/ml, P=0.042;48周(3.4±1.1)Log10copies/ml vs.(3.9±1.4)log10copies/ml, P=0.002。截止到2011年7月共16例(3.8%)发生HBsAg阴转,12例(2.8%)发生HBsAg血清学转换。PEG-IFN组的总体HBsAg阴转率和血清学转换率明显高于IFN组,7.2%(13/180) vs.1.2%(3/204), P=0.005;5.0%(9/180) vs.1.2%(3/204), P=0.048,差异有统计学意义。2、317例HBeAg阳性患者中,PEG-IFN组24周(35.0%vs.23.2%,P=0.023)、48周(69.6%vs.51.9%,P=0.011)时HBV DNA阴转率均高于IFN组。PEG-IFN组12、24、48周HBeAg阴转率分别为5.9%(7/118)、17.9%(21/117)、38.3%(30/79),IFN组分别为6.0%(12/199)、14.1%(28/198)、34.6%(46/133),两组间差异均无统计学意义。两组间HBeAg血清学转换率差异同样无统计学意义。24周时PEG-IFN组的WBC、Neu、Pit中位数水平明显低于IFN组：3.6×109/L vs.4.4×109/L, P0.001;1.8×109/L vs.2.2×109/L, P=0.011;131.5×109/L vs.155.5X109/L, P=0.001。48周时PEG-IFN组的WBC、Neu中位数水平明显低于IFN组：3.7×109/Lvs.4.6×109/L, P=0.013;1.8×109/Lvs.2.2×109/L, P=0.026。3、106例HBeAg阴性患者中,PEG-IFN与IFN组间HBVDNA阴转率、HBsAg阴转率和血清转换率差异均无统计学意义；仅在24周时PEG-IFN组WBC中位数水平(3.3×109/Lvs.4.6×109/L, P=0.003)和Neu中位数水平(1.8×109/Lvs.2.4×109/L, P=0.009)明显低于IFN组。4、PEG-IFN治疗组中≥27岁患者HBV DNA阴转率高于IFN组(77.7%vs.57.4%,P<0.001),而<27岁患者HBsAg阴转率(16.0%vs.2.3%,P=0.008)和血清转换率(12.0%vs.2.3%,P=0.049)高于IFN组。5、在观察和比较长效干扰素和短效干扰素治疗CHB患者的疗效过程中发现HBeAg、抗-HBe同时阳性的特殊现象。在上述317例治疗前为HBeAg阳性患者中共发现该现象80例,占25.2%。6、干扰素治疗的317例HBeAg阳性CHB患者,男性227例,女性90例,平均年龄(28.6±8.1)岁。其中病例研究组(出现HBeAg/抗-HBe双阳性)80例,占25.2%；而对照组(未出现HBeAg/抗-HBe双阳性)为237例,占74.8%。病例研究组治疗前的HBeAg滴度明显低于对照组187.5(1.1～1206.4) S/CO vs.321.9(1.0～3111.2) S/CO, P=0.003。7、以上病例研究组中的80例患者首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性时,HBV DNA平均载量为(3.8±1.2) log10copies/ml, ALT (ULN)水平中位数(范围)为1.0(0.2～4.0)；HBeAg滴度中位数(范围)为3.4(1.0～187.5) S/CO,抗-HBe滴度中位数(范围)为0.5(0.03-0.99)S/CO,两者均接近各自截断值。8、以是否产生HBeAg/:(?)-HBe双阳性为因变量,以患者年龄、性别、干扰素种类、治疗前HBV DNA为自变量,用二分类Logistic回归分析HBeAg阳性患者中,]HBeAg/抗-HBe双阳性出现的影响因素,结果显示：男性患者更容易出现HBeAg/抗-HBe双阳性,OR值为1.9(95%CI：1.013-3.518,P=0.046)。9、病例研究组的HBV DNA阴转率、HBeAg阴转率及血清学转换率分别为：76.2%(61/80)、62.5%(50/80)、61.2%(49/80),均高于对照组的49.8%(118/237)、35.9%(85/237)、29.1%(69/237),差异均有统计学意义。10、为了研究不同情况下产生的HBeAg/抗-HBe双阳性的临床特征,我们重新收集418例患者HBeAg/抗-HBe双阳性时的横断面资料,并分为三组：干扰素组148例,核苷组105例,自发组165例。三组间自发组的HBV DNA差别显著(P<0.001),以自发组最高5.4(3.0-8.1) log10copies/ml,以核苷组最低3.0(3.0-5.6) log10copies/ml;三组间血清ALT差别显著(P<0.001),以自发组最高82.0(9.0～2144.0)U/L,以核苷组最低23.0(9.0～181.0)U/L;三组间血清TBIL差别显著(P<0.001),以自发组最高21.2(5.0～650.9)μmol/mL,干扰素组最低13.3(6.7～27.9)μmoL三组间血清抗-HBe滴度差别显著(P<0.001),以核苷组最低0.7(0.07～0.99)S/CO。11、在上述病例研究组中选取的20例患者,经测序分析,发现基线、双阳性时、转归后三个时间点的血清中HBV前C/C、BCP区的核苷酸和C区氨基酸的变异差异均无统计学意义。12、用尿素洗脱法检测血清中的抗-HBe相对亲和力指数,发现双阳性血清中抗-HBe相对亲和力指数为92.6(39.4-240.7)%,明显低于抗-HBe单阳性的104.7(39.6～252.4)%,差异有统计学意义(P=0.001)。结论：1、聚乙二醇化干扰素治疗慢性乙型肝炎时,在HBV DNA阴转率、HBsAg阴转率及其血清学转换率均优于普通干扰素,但骨髓抑制较明显。2、干扰素治疗HBeAg阳性CHB患者时,约有四分之一(25.2%)的患者会出现HBeAg/抗-HBe双阳性现象,且多见于男性。3、干扰素治疗过程中出现HBeAg/抗-HBe双阳性的患者,与未发生双阳性的患者相比,更易发生HBeAg血清学转换。4、不同情况下,HBeAg/抗-HBe双阳性的临床特征有所不同。与干扰素组和核苷组相比,自发组中HBV DNA、ALT、TBIL水平最高。但血清抗-HBe滴度在核苷组中最低。5、干扰素治疗过程中出现的HBeAg/抗-HBe双阳性现象与HBV前C/C、BCP区的核苷酸变异和C区的氨基酸变异关系不大。6、HBeAg/抗-HBe双阳性血清中抗-HBe的相对亲和力较抗-HBe单阳性低,可能是检出HBeAg/抗-HBe同时阳性的原因之一。