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在我国青藏高原由于平均海拔过高,导致空气中平均氧含量只有13%左右,远低于正常大气压中21%的氧含量。研究表明,长期暴露于高原环境中会影响人类神经系统的发育及其功能,从而影响大脑的学习记忆功能。大脑海马体内神经元主要负责学习和记忆,而功能正常的神经元及神经元可塑性是大脑学习记忆的关键。高原低氧暴露会引起神经元的损伤,导致学习记忆功能障碍[1]。神经元中线粒体对神经元的发育、生长及功能实现起着重要作用,同时也是低氧暴露神经元损伤的敏感细胞器,低氧暴露会诱导线粒体损伤。HUMMR蛋白是一种定位于线粒体外膜的低氧应激蛋白,对神经元轴突内线粒体运输起到调节作用,而HUMMR是否参与低氧导致的线粒体损伤过程尚未见报导。线粒体融合分裂平衡的破坏是线粒体损伤的前期表现,其相关蛋白是参与线粒体损伤的重要蛋白。MEF2(Myocyte enhancer factor,肌细胞增强因子)蛋白家族隶属转录因子MADS转录因子家族,其中MEF2D可能通过调节其他核基因或线粒体基因转录参与线粒体功能的调节,进而影响神经元生存及其正常功能维持,但是MEF2D、HUMMR和线粒体融合、分裂相关蛋白在低氧诱导的神经元损伤中的作用及分子机制有待于进一步研究。研究目的本研究通过建立低氧诱导线粒体损伤的体外模型,观察低氧对神经元线粒体损伤的影响及特点,阐明HUMMR蛋白在线粒体损伤中作用及分子机制,揭示MEF2D对HUMMR蛋白及线粒体损伤的调控作用,研究结果对于预防和治疗低氧诱导的线粒体损伤相关疾病具有重要意义。研究方法:1.低氧暴露细胞模型的建立:利用DWS低氧工作站,建立SH-SY5Y细胞及原代培养神经元1%低氧暴露模型。2.质粒构建:构建HUMMR-GFP高表达质粒、HUMMR-sh RNA干涉慢病毒质粒。3.慢病毒载体的构建:采用ps-PAX2、p MD2.G、HUMMR-sh RNA-PLKO重组慢病毒载体共转染293T细胞,包装成完整病毒。4.免疫荧光染色方法结合激光共聚焦显微镜检测线粒体形态:用Mito-Tracker Red线粒体荧光探针及p Ds Red2-Mito质粒染色线粒体,用激光共聚焦观察线粒体分布及形态变化。5.线粒体膜电位检测:通过JC1(线粒体膜电位检测法)染色,荧光显微镜观察细胞膜电位变化。6.用电子显微镜方法观察细胞内线粒体的超微结构。7.利用western-blot的方法检测蛋白表达水平。研究结果:1.低氧暴露对线粒体形态和功能的影响:免疫组织化学结果显示,1%低氧暴露24h和48h后,与对照组相比,SH-SY5Y细胞及原代培养神经元细胞的线粒体均出现不同程度的片断化;线粒体膜电位水平明显下降。2.低氧暴露对线粒体相关蛋白表达的影响:western-blot结果显示:低氧暴露后可以使HUMMR蛋白、MEF2D蛋白和线粒体融合蛋白MFN2表达水平明显降低。3.高表达HUMMR对低氧诱导的线粒体片段化的影响:高表达HUMMR的细胞用1%低氧处理,与正常表达HUMMR的细胞相比,高表达HUMMR可以部分改善低氧诱导的线粒体片段化,低氧诱导的MFN2蛋白表达下降也有一定程度的回升。4.低表达HUMMR对低氧诱导的线粒体片段化的影响:低表达HUMMR的细胞用1%低氧处理,与正常表达HUMMR的细胞相比,低表达HUMMR加剧了低氧诱导的线粒体片段化和MFN2蛋白表达下降。5.MEF2D对低氧诱导的HUMMR蛋白表达及线粒体片断化的调控作用:(1)与对照组相比,低氧暴露后MEF2D水平呈下降趋势。(2)高表达MEF2D后,可部分恢复低氧诱导的线粒体片断化,同时低氧诱导的HUMMR蛋白水平下降也有一定程度的回升。研究结论:本研究通过建立低氧诱导线粒体损伤的体外模型,证实低氧可以引起神经元线粒体片断化和膜电位水平下降,发现HUMMR蛋白在其中发挥着重要作用,阐明了低氧是通过核转录因子MEF2D调节HUMMR进而影响线粒体融合蛋白MFN2的表达水平,最终导致了线粒体片断化的发生,研究结果对于预防和治疗低氧诱导的线粒体损伤相关疾病具有重要的指导意义。