丙溴磷、马拉硫磷、啶虫脒残留检测新技术研究

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农药残留问题是世界各国普遍关注的食品安全和环境安全问题之一,建立有效的农药残留检测技术体系是对农药残留问题进行监测和控制的前提与基础。目前认为,理想的农药残留检测体系应该以农药残留快速检测技术作为现场初筛工具,以农药残留检测标准方法作为最终的定性定量确证工具。在此背景下,本论文以农药残留检测新技术研究为主题开展了以下三个方面的研究工作。(1)农药残留检测的各级标准方法有升级为色谱-质谱联用技术的趋势,因此论文首先开展了基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的丙溴磷定性定量检测技术及其配套样品前处理方法的研究,并进一步应用所建立的方法对丙溴磷在稻田环境中残留规律进行了探讨。研究结果表明:(a)在试验所设条件下可选择m/z 302.8和m/z 344.8分别作为丙溴磷检测的定性、定量子离子;(b)所建立的丙溴磷定性定量检测技术在水稻植株、稻田土壤、田水、糙米、以及稻壳等样品中的添加回收率均在80%以上,并且稳定(相对标准偏差在1.05%9.65%之间),最低检测限则达到10-9(即μg/kg)水平;(c)稻田环境下,丙溴磷在水稻植株、稻田土壤、以及田水等部位的降解规律遵循一级动力学方程,半衰期分别为5.47 d、3.75 d、3.42 d;(d)按照推荐剂量(600 g.ai/hm2)在水稻种植中施用40%丙溴磷乳油,最少需要间隔21 d以确保稻米的食用安全。(2)免疫检测技术(IA)是农药残留快速检测技术中研究应用最为广泛的一种。目前农药残留免疫检测通常是通过竞争模式来实现,该模式在检测灵敏度、精确度、线性范围等方面不如非竞争模式。因此,论文研究采用噬菌体展示技术进行了甲氧基有机磷农药抗独特型抗体的制备,并以马拉硫磷为典型对象研究建立了基于抗独特型抗体的非竞争免疫检测技术。研究结果表明:(a)采用碳二亚胺法能够成功将带有羧基活性基团的甲氧基有机磷农药通用半抗原与氨基修饰的琼脂糖凝胶偶联,利用偶联产物对甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体进行纯化时能够获得良好的纯化效果;(b)以纯化的广谱特异性抗体为固相抗原,采用噬菌体展示技术成功从天然人源噬菌体抗体库Tomlinson I+J中筛选出12个抗独特型抗体(AId),经进一步鉴定,其中B9和D11分别属于α-AId和β-AId且具有相对较高的活性;(c)以B9和D11为主要材料建立起的非竞争免疫检测技术针对马拉硫磷的中抑制浓度(IC50)和最低检测限(S/N=3)分别为113.7±34.18μg/L和10.54μg/L。(3)农药残留免疫检测技术中的另一瓶颈因素是针对农药小分子的高质量特异性抗体制备困难。核酸适体(Aptamer)作为一种具有替代抗体潜能的新型仿生生物识别分子,是近年来相关领域的研究热点。因此,论文的第三部分开展了啶虫脒核酸适体筛选的研究工作,并对基于核酸适体的啶虫脒快速筛查技术进行了初步的探索。研究结果表明,(a)试验所采用的非固相化核酸适体筛选策略中各关键环节均有效;(b)以啶虫脒为靶分子,经过18轮重复筛选,成功获得14条不同核酸适体,其中S18具有最高的活性,其表观解离常数(Kd)约为4.98μmol/L,并且对啶虫脒具有高度的特异性;(c)以S18为关键材料建立起的啶虫脒快速筛查技术最低能够检测出浓度约为0.05 mmol/L(11.1 mg/L)的啶虫脒。
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