视觉作为人类最重要的感知觉,承担人类80%以上的外界信息获取。视网膜则是视觉功能的起始器官,其位于眼球底部,含有多种严格分层的神经元和胶质细胞。视网膜中的感光细胞负责把光信号转化为电信号,通过多级神经元,将信号最终传输给大脑中枢。但是,遗传性视网膜退行性疾病由于基因突变或者缺失,导致感光细胞不可逆死亡,剥夺了患者看见光明的机会。视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)便是其中的一大亚类,其致病基因广,基因突变高度异质化,目前治疗手段发展仍十分缓慢。视网膜色素变性是一种较为常见的遗传性视网膜疾病。研究发现患者发病初期由于视杆细胞死亡而出现夜盲症,后期伴随着视锥细胞的逐渐丧失,白天视力下降,最终完全致盲。目前有超过50个基因被鉴定与视网膜色素变性相关。为了研究视网膜色素变性的潜在致病机制并开发相应的治疗方法,研究者已经建立了多个视网膜色素变性啮齿类动物模型,如rd1,rd10,Rho-/-和RhoP23H/+突变小鼠等。这些模型表现出感光细胞和视力的逐渐丧失,部分模拟了人类视网膜色素变性病理特征。然而,啮齿类动物与人类在进化上相距较远,在遗传学水平上和生理学水平上存在明显差异,特别是啮齿类动物的视网膜没有黄斑和中央凹结构,而这特化的区域对人类视觉的高视敏度十分重要;因此,啮齿类动物模型并非一好的临床前模型。与之相比,非人灵长类(non human primate,NHP)与人类在进化上更为接近,有着许多遗传、解剖、生理、免疫和行为上的相似之处,特别是旧世界猴(the old world monkey),如猕猴的视网膜具有黄斑和中央凹结构。为了更好的模拟人类视网膜色素变性致病机制,以及开展相应的临床前研究,非人灵长类视网膜色素变性动物模型亟待被建立。相比于啮齿类动物模型丰富多样的遗传修饰技术,目前非人灵长类的遗传修饰技术非常有限,后者主要是通过生殖细胞基因编辑来实现。然而,由于猕猴生殖细胞基因编辑难度高,猕猴繁殖周期长,成本高,并且很难实现生殖系遗传,此类非人灵长类动物模型很难推广并大范围使用。相反,利用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)结合成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats,CRISPR)基因编辑工具进行在体基因编辑,直接原位构建非人灵长类动物模型,可能是更为高效经济的方法。CRISPR/Cas9是一种靶向核酸内切酶,其利用一个向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)来指导Cas9在靶基因座处产生双链DNA断裂(double-stranded DNA breaks,DSB),并在非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)DNA修复中产生DNA随机插入或缺失(insertions and deletions,indels),后者会造成开放阅读框移码(open reading frame shift,ORF shift)从而实现基因敲除。值得注意的是,AAV转导的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以通过选择性操纵特定组织区域中的基因表达,以进行组织和区域特异性研究。由RHO基因编码的视紫红质是第一个被鉴定的视网膜色素变性突变蛋白,它是一个位于视杆细胞外段中的G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR),对于光信号转导至关重要。现研究工作表明,RHO是常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal-dominant RP,adRP)的主要致病基因。为了模拟由RHO缺失引发的视网膜色素变性,并研究RHO基因的非生殖系突变是否足以导致视网膜色素变性表型,我们利用腺相关病毒(AAV)转导的CRISPR/SaCas9技术,在体敲除成年恒河猴视网膜中的RHO基因。我们对AAV-CRISPR/SaCas9注射后的猕猴视网膜进行了一系列分子,细胞和生理学三个层次的分析,包括:利用de novo sequence深度测序、western blot和免疫组化,证明了猕猴视杆细胞RHO基因及蛋白被有效敲除;利用免疫组化、眼底荧光造影成像(FFA)、光学相干断层扫描(OCT)和透射电子显微镜(TEM),证明了感光细胞退化、视网膜变薄、视杆细胞亚细胞结构变性;利用离体ERG记录,证明了视网膜感光细胞光反应降低。因此,RHO基因原位敲除的猕猴表型复制了人类视网膜色素变性疾病。综上,我们利用AAV-CRISPR/SaCas9成功实现恒河猴视网膜RHO基因体细胞编辑,建立了非人灵长类视网膜色素变性疾病模型。此动物模型对于研究人类视网膜色素变性病理机制及制定相应治疗策略有重要推动意义。利用在体基因编辑构建非人灵长类动物模型,可以拓展到其他遗传性疾病动物建模,推动非人灵长类模型在人类疾病研究中的应用。同时,在体基因编辑技术还可应用到基因治疗等领域,值得进一步推广研究。