目的:随着物质生活水平的提高,我国民众可获取的精加工食物及种类极大丰富,造成能量摄入的普遍升高。过量的脂类和碳水化合物的摄入,对人体来说从营养物质变成了毒物,不仅造成能量过剩,导致肥胖,还对机体其他器官造成严重负担,肝脏便是主要受累的器官之一。非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)主要指一类不以饮酒、药物或其他病毒为诱因的脂肪肝,其中包括简单的脂肪化和进展到肝炎期的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH),如不加以有效的干预和治疗,可继发肝脏纤维化从而进展为肝硬化,并大大增加罹患肝癌的风险。NAFLD是一种代谢性疾病,与多种慢性代谢性疾病,如胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病等密切相关,所以最近国际肝病专家组提出将NAFLD更名为MAFLD(Metabolic associated fatty liver disease)。刚刚发表的流行病学调查显示,我国NAFLD的患病率已达29.2%,已超过全球患病率,且发病人群逐渐低龄化,加之与其他代谢性疾病间的协同恶化作用,给社会带来了极大的负担,所以NAFLD在我国已成为严重的公共卫生问题,有效预防与干预策略的探索已刻不容缓。NAFLD的主流致病机制归纳为“二次打击”学说,其中氧化应激和炎症反应为两大重要机制,且相互促进。转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,NRF2)是调节抗氧化反应的中枢因子,通过调控多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的转录表达以对抗氧化应激。随着近年来研究的深入,NRF2在调控炎症和脂代谢中的作用也不断被发现。以往研究利用Nrf2全身敲除的小鼠模型进行NAFLD造模,但实验结果由于小鼠遗传背景、暴露时间、饲料配方不同等原因,最终得到的结果不尽相同,对机制的解析也并不明确。此外,全身的Nrf2缺乏并不能准确的解释肝脏中NRF2对NAFLD的影响,所以我们建立了细胞特异性Nrf2敲除小鼠模型。肝脏的主要实质细胞包括肝细胞和枯否细胞(肝脏巨噬细胞),二者与脂质代谢和炎症反应密切相关。本论文分为三部分,第一部分对肝细胞特异性Nrf2敲除的小鼠进行研究,主要着眼于肝细胞内NRF2在氧化应激和脂质代谢中的作用;第二部分对巨噬细胞特异性Nrf2敲除小鼠进行炎症反应的研究;最后在原代肝细胞中研究具体分子机制。通过三个部分的研究,旨在系统研究NRF2在不同细胞中对于NAFLD的作用,为预防和治疗疾病提供新的理论依据。研究方法:1.细胞特异性Nrf2敲除小鼠给予12周高脂肪饮食暴露建立NAFLD模型利用Nrf2-LoxP与Albumin-Cre工具鼠杂交获得肝细胞特异性Nrf2敲除(Nrf2(L)-KO)小鼠及同窝出生的对照组(Nrf2-Lox P)小鼠。雄性和雌性12周龄的两种基因型小鼠,分别给予正常饲料组(Chow diet,CD)或高脂肪饲料组(Highfat diet,HFD),分为Nrf2-LoxP,CD组,Nrf2(L)-KO,CD组,Nrf2-Lox P,HFD组,Nrf2(L)-KO,HFD组共4组,每组6-8只。每组小鼠喂饲对应饲料12周,动态监测饮食饮水数据,每周测量小鼠体重,并进行小鼠体脂成分和血糖指标的监测。观察终点收取小鼠血浆和各重要脏器组织样品。同上述方法利用Nrf2-LoxP与Lysozyme2-Cre工具鼠杂交获得巨噬细胞特异性Nrf2敲除(Nrf2(Mφ)-KO)小鼠及同窝出生的对照组(Nrf2-LoxP)小鼠。取雄性的12-16周龄的两种基因型小鼠,随机分为以下4组:Nrf2-LoxP,CD组,Nrf2(Mφ)-KO,CD组,Nrf2-Lox P,HFD组,Nrf2(Mφ)-KO,HFD组,每组6只,相应饲料喂养12周。监测与处理同上。2.体内实验样品处理利用试剂盒检测血浆及肝组织中自由脂肪酸、甘油及甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量;利用经4%多聚甲醛固定后的肝组织进行H&E染色、油红染色及免疫组织化学染色;测定肝脏中丙二醛的含量;提取肝脏组织的总RNA,对氧化应激、糖代谢、线粒体氧化、脂代谢、炎症反应及纤维化反应的相关基因进行转录水平检测;提取肝脏组织总蛋白对NRF2、过氧化物酶体增殖剂激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)等关键蛋白水平进行检测等。3.利用Nrf2缺失的原代肝细胞研究脂质调控的分子机制取同窝同性别的Nrf2(L)-KO和对照小鼠,提取原代肝细胞作为实验材料;给予原代肝细胞PPARγ激动剂处理检测Pparg及其下游基因表达;模拟生理条件运用饱和脂肪酸棕榈酸处理原代肝细胞,验证PPARγ及其下游表达水平、测量原代细胞内TG含量并利用荧光染色标示TG蓄积;利用荧光示踪脂肪酸摄取效率;利用Seahorse线粒体应激压力实验检测原代细胞线粒体功能;分别利用PPARγ1和PPARγ2过表达质粒瞬转入原代肝细胞,检测Pparg下游脂质代谢基因表达水平等揭示其分子机制的研究。结果:1.肝细胞特异性Nrf2缺失对小鼠的体重、血脂血糖等指标的变化没有影响,但减轻HFD组小鼠的肝重和肝脏脂肪化程度。HFD组小鼠的能量摄入均高于CD组(P<0.05),但两基因型间没有差别,小鼠的体重、体脂结果与能量摄入的趋势相符合。在12周暴露终点对HFD组进行葡萄糖耐量实验显示基因型间无差别。经心脏绝对重量矫正的小鼠重要脏器的脏器系数显示,肝脏、性腺旁脂肪和皮下脂肪在HFD组均有明显升高(P<0.05),三种脂肪在两基因型间没有差别(P>0.05),但Nrf2(L)-KO组小鼠的肝脏显著小于对照组(P<0.05),即肝脏重量偏小。肝脏内TG含量在Nrf2(L)-KO,HFD组也出现了显著降低(P<0.05)。为排除小鼠个体差异,将H&E染色结果按NAS评分,发现Nrf2(L)-KO组在高脂肪饮食暴露后,肝细胞内的脂质蓄积减少。2.肝细胞特异性Nrf2缺失对小鼠氧化应激及纤维化水平无影响,对HFD暴露后的脂质代谢和炎症反应有影响。两基因型小鼠HFD组的Nrf2及其下游基因谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,Gclc),NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,Nqo1)和血红素加氧酶(Hemeoxygenase 1,Ho1)的mRNA表达较CD组都没有明显升高,且NRF2在四组小鼠中的蛋白表达也是类似的结果。四组小鼠肝脏的丙二醛含量没有明显差别。HFD组小鼠的促炎因子Ccl2和Tnf的mRNA水平都有明显的升高(P<0.05),但两基因型间没有差别。对NF-κB(p65)的磷酸化水平进行蛋白水平检测中发现,Nrf2-LoxP,HFD组比CD组有明显升高,但在Nrf2缺失组未见变化。在F4/80的免疫组化染色中发现Nrf2(L)-KO比Nrf2-Lox P组的着色浅,范围小。综合以上结果,高脂肪饮食诱导了肝脏内炎症反应,且Nrf2缺失时炎症反应会减轻。在对纤维化相关基因检测中未见到明显改变。肝脏组织基因表达检测发现HFD暴露后两基因型中肉毒碱棕榈酰转移酶(Carnitine palmitoyl transferase,Cpt)的表达均下降了50%(P<0.05),说明线粒体内β氧化能力下降。Pparg2在HFD暴露后的对照组有升高趋势而Nrf2缺失组增幅不明显,蛋白表达水平与mRNA结果一致。3.巨噬细胞内Nrf2缺失对小鼠高脂肪饲料暴露无明显影响HFD组两基因型小鼠的能量摄入都较CD组有明显升高(P<0.05),体重升高的趋势与能量摄入相符,但在基因型间均未见明显差异;高脂肪饮食暴露后的小鼠体脂较CD组有明显的升高(P<0.05),血糖有升高趋势(P>0.05),但在基因型间未见明显差别;在12周暴露终点对HFD组行葡萄糖耐量试验,未见基因型间有明显差别;HFD暴露后经心脏重量矫正的脏器系数在肝脏、性腺旁脂肪和皮下脂肪组织升高明显(P<0.05),但基因型间没有差别;HFD暴露后小鼠肝组织中的TG含量均有升高,但两基因型间没有差别,且肝脏H&E染色结果也未见明显差别;Nrf2以及其下游基因Gclc在高脂后有升高趋势,但与CD组相比没有统计学差异,在Nqo1和Ho1中四组间均没有明显差别;HFD组小鼠的促炎因子Ccl2和Tnf的mRNA水平有明显的升高(P<0.05),但两基因型间没有差别;其他炎症因子,如Il6,Il10,Adgre1和Il1b在四组间均没有差别。4.Nrf2缺失原代肝细胞PPARγ活性降低,但与线粒体呼吸功能无关。PPARγ激动剂处理原代肝细胞后,Nrf2-LoxP细胞的Pparg及下游基因均升高,但Nrf2缺失组升高有限或不升高,与对照组有显著差异(P<0.05)。饱和脂肪酸处理后的Nrf2(L)-KO原代肝细胞的Pparg及下游基因的表达升高有限,低于Nrf2-Lox P细胞表达水平(P<0.05);PPARγ1,PPARγ2的蛋白表达水平也低于Nrf2-LoxP组。脂肪酸处理24小时后,Nrf2(L)-KO肝细胞内的TG含量低于Nrf2-LoxP对照细胞(P<0.05);脂肪酸摄取速率也低于Nrf2-LoxP对照细胞(P<0.05)。经Seahorse线粒体压力实验检测发现两种基因型细胞的产酸率和耗氧率无明显差异。5.Nrf2缺失的原代肝细胞经PPARγ过表达后脂代谢相关基因表达得到逆转。Nrf2(L)-KO原代肝细胞瞬转过表达PPARγ1,PPARγ2,PPARγ下游的脂肪酸转运基因和脂肪合成基因恢复到与Nrf2-Lox P对照细胞同一水平。结论:1.肝细胞特异性Nrf2基因敲除小鼠在高脂肪饮食后,肝脏增重减缓,肝细胞内脂肪化程度降低。12周高脂肪饮食暴露对于肝脏的氧化应激水平没有显著影响,基因型间没有差别;但肝脏脂肪化加重并诱发炎症的产生。NRF2在NAFLD中的脂质调控作用通过调控PPARγ的表达实现。2.巨噬细胞Nrf2缺失对于12周高脂肪饮食暴露诱导的NAFLD的脂质代谢,氧化应激水平和炎症反应均没有明显影响。3.在PPARγ激动剂、饱和脂肪酸处理中,Nrf2缺失的原代肝细胞的Pparg及下游脂代谢基因均下调。PPARγ过表达原代细胞时,部分表型被逆转,说明肝细胞内NRF2是通过调控PPARγ的表达而影响肝细胞的脂质代谢能力。