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有机-无机杂化整体柱是一种新型整体柱材料,具有制备简单、机械强度好、pH适用范围广等优点。核酸适配体是一种单链DNA或RNA的寡核苷酸,能够与目标分析物发生特异性结合,具有亲和力强、稳定性好、易于化学修饰等优点。近年来,基于核酸适配体的亲和整体柱得到了极大关注,被广泛应用于液相色谱、毛细管电泳、固相微萃取等领域。本文发展了一种制备核酸适配体亲和杂化整体柱的新方法。首先,采用溶胶-凝胶方法制备了四甲氧基硅烷-γ-甲基丙烯酸丙基三甲基硅烷(TMOS-γ-MAPS)有机-无机杂化整体柱；然后,利用“巯-烯”点击反应将末端被巯基修饰的核酸适配体固载在杂化柱上,得到亲和杂化柱,并用来富集凝血酶；最后,利用酶催化显色反应的方法实现了快速、灵敏检测凝血酶的目的。1.“巯-烯”点击反应制备核酸适配体亲和杂化柱杂化整体柱的形貌、结构及表面配体密度等性质决定了整体柱的色谱行为,对目标物的分析有极大影响。为得到具有理想结构的亲和整体柱材料,我们选择四甲氧基硅烷(TMOS)和γ-甲基丙烯酸三甲氧基硅烷(γ-MAPS)为前驱体,采用溶胶-凝胶法制备了含双键的杂化整体柱。然后,利用“巯-烯”点击化学,将末端被巯基修饰的核酸适配体固定在杂化整体柱上,得到基于核酸适配体的亲和杂化整体柱。通过改变前驱体比例(TMOS/γ-MAPS)、致孔剂、催化剂用量等条件,优化了整体柱的渗透性和孔隙率,制备出比表面积大、特异性强的亲和柱。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对化学结构分析结果显示核酸适配体成功键合在材料表面,同时元素分析(EA)结果计算亲和柱表面核酸适配体的覆盖密度达420pmol/μL。2.核酸适配体亲和杂化柱富集与检测凝血酶本文将最优条件下得到的核酸适配体亲和整体柱用于蛋白质的富集与检测。我们以凝血酶为模型物,将适配体亲和杂化柱的富集作用与酶催化显色反应的信号放大作用结合,实现了对痕量蛋白质的快速、高灵敏检测。通过改变洗脱剂种类、pH值、洗脱温度和催化显色条件,实现了对目标蛋白的有效洗脱与高灵敏检测。在最优条件下,核酸适配体亲和柱对凝血酶的富集倍数为3,复杂基质中(1%人血清)的检测回收率为91.8%。结果说明,“巯-烯”点击化学为核酸适配体亲和柱的制备提供了一个新方法,并实现了亲和柱在分离与富集痕量蛋白质方面的应用。