研究目的观察川椒方含药血清对过敏性结膜炎(Allergic Conjunctivitis,AC)IKK/IκB/NF-κB信号通路、组胺释放水平及炎症因子IL-6的影响,进一步探讨川椒方治疗过敏性结膜炎的作用机制。研究方法1.川椒方含药血清制备:将20只正常SD雄性大鼠分为2组,即川椒方含药血清组和空白血清组。含药血清组按灌胃体积20ml/kg、浓度1.24g/ml的川椒方中剂量药液灌胃,每日2次,连续给药7天;空白组给予等量生理盐水。制备SD大鼠川椒方含药血清以及空白血清。2.体外培养RBL-2H3细胞,对细胞进行传代、冻存及复苏,待细胞生长状态良好,数量达对数生长期时进行实验。3.用CCK-8法检测川椒方含药血清对RBL-2H3细胞活性的影响,含药血清组及空白血清组均设6个浓度(5%、10%、15%、20%、25%、30%)进行实验。4.细胞铺板后,加入anti-DNP IgE刺激RBL-2H3细胞致敏,孵箱中孵育过夜;加入抗原DNP-BSA作用RBL-2H3细胞,建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型。实验分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药物对照组、川椒方低剂量含药血清组、川椒方中剂量含药血清组、川椒方高剂量含药血清组。5.用甲苯胺蓝染色法观察细胞形态。6.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测川椒方脱颗粒上清液中组胺释放水平及IL-6的释放水平。7.用实时定量 PCR(RT-PCR)法检测 RBL-2H3 细胞 Iκ B-α、IKK-β、NF-κ B、基因(mRNA)的表达情况。研究结果1.CCK-8法检测各血清组对RBL-2H3细胞活性的影响,结果显示:15%空白血清,10%、15%、30%含药血清对RBL-2H3细胞活力影响最小,故本实验选取15%空白血清,10%、15%、30%含药血清作为川椒方剂量梯度进行实验。2.甲苯胺蓝染色:对正常RBL-2H3细胞及细胞脱颗粒进行染色观察:正常细胞呈梭形,细胞膜光滑有光泽,轮廓清晰,细胞胞浆着染成蓝色;当细胞脱颗粒时,RBL-2H3细胞出现表面突起,当细胞脱颗粒完成后,细胞变大、变圆,胞内炎性介质释放,胞浆变稀疏,染色变浅,中间出现空泡状,细胞膜边缘不规则。3.ELISA检测组胺以及IL-6分泌量:正常组细胞组胺、IL-6分泌量少,抗原DNP-IgE、抗体DNP-BSA致敏激发后,RBL-2H3细胞上清组胺、IL-6释放明显增多,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明抗原DNP-IgE、抗体DNP-BSA致敏造模可致RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺及炎症因子IL-6产生。阴性对照组、阳性药物组、川椒方各剂量组组胺、IL-6分泌均增加;与模型组比较,含药血清各组及阳性药物对照组细胞上清液中组胺、IL-6表达量均显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),说明含药血清及阳性药物可抑制RBL-2H3细胞脱颗粒中组胺及IL-6的释放。与阴性对照组比较,阳性药物组、川椒方各剂量组组胺、IL-6释放率下降,差异有统计学意义(P<0.05);与阳性药物组比较,川椒方各治疗组抑制组胺、IL-6释放的能力不足,差异有统计学意义(P<0.05);含药血清各组间比较,组胺及IL-6分泌量差异无统计学意义(P>0.05)。4.PCR:与正常组比较,模型组 RBL-2H3 细胞 IκB-α mRNA、IKK-β mRNA、NF-κBmRNA表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),说明抗原DNP-IgE、抗体DNP-BSA致敏造模后,细胞中I κ B-α、IKK-β、NF-κ B表达增加。与模型组比较,阳性药物对照组及含药血清组I κ B-α、IKK-β、NF-κ B mRNA水平下降明显,差异具有统计学意义(P<0.05),说明阳性药物PP2及含药血清可下调RBL-2H3致敏细胞中I κ B-α、IKK-β、NF-κ B mRNA的表达。与阳性药物对照组比较,川椒方各剂量组下调I κ B-α、IKK-β、NF-κ B mRNA水平能力不足,差异有统计学意义(P<0.05);含药血清剂量组间比较,IKK-β mRNA、NF-κ B mRNA水平下降不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.川椒方对肥大细胞脱颗粒过程中组胺及炎症因子IL-6的释放有抑制作用。2.川椒方治疗过敏性结膜炎的机制可能与稳定肥大细胞脱颗粒中调控I κB-α/IKK-β/NF-κ B信号通路相关因子的表达有关。