论文部分内容阅读
目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48k D转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。方法:(1)用Consite方法分析人SPAG16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织c DNA为模版,构建含有SPAG16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/p GL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pc DNA3和S-SOX5/p Target)以及抑制其表达的si RNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/p GL3转染至BEAS-2B细胞,以p GL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pc DNA3转染至BEAS-2B细胞,以pc DNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L m RNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pc DNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5 RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5 RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(Ch IP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48k Da的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16Lm RNA的水平。SOX5 RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。Ch IP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPAG16L的表达。结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPAG16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。