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背景免疫毒素是一类将抗体和毒素分子通过化学偶联或基因工程改造后由原核表达系统生产获得的具有靶向性的细胞毒素融合蛋白[1,2]。免疫毒素在临床实验中具有良好的抗肿瘤效果,但存在半衰期短、免疫原性和脱靶毒性等一系列问题,针对这些问题,我们构建了一系列新型免疫毒素,旨在探究这些新型免疫毒素的抗肿瘤效果和作用机制。我们的研究分为两部分,第一部分是双靶向免疫毒素对人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阳性肿瘤的治疗效果和作用机制研究;第二部分是低免疫原性和脱靶毒性的新型免疫毒素对曲妥珠耐药肿瘤细胞的治疗效果和作用机制研究。第一部分靶向HER2和PDGFRβ的长半衰期双特异性免疫毒素IHPP对HER2阳性肿瘤的治疗效果研究目的1.构建能够同时靶向HER2和血小板衍生生长因子受体（Platelet-derived growth factor receptorsβ,PDGFRβ）的双特异性免疫毒素;2.检测双特异性免疫毒素的双靶向效果;3.探究双特异性免疫毒素在体内外的抑瘤效果及潜在作用机制。方法1.构建及表达能够同时靶向HER2和PDGFRβ的双特异性免疫毒素;2.酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测分析双特异性免疫毒素与HER2和PDGFRβ的结合力;3.免疫荧光检测分析双特异性免疫毒素的靶向性;4.构建NCI-N87裸鼠移植瘤模型并通过免疫组化和肿瘤体积评估双特异性免疫毒素的体内抑瘤效果;5.抗肿瘤治疗后转录组测序分析双特异性免疫毒素抗肿瘤的潜在作用机制。结果1.成功构建并表达纯化了能够同时靶向识别HER2和PDGFRβ的双特异性免疫毒素IHPP以及对照组单靶向免疫毒素IHP和IPP。Ig G结合免疫毒素后的细胞毒性实验结果表明,免疫毒素抗肿瘤活性并不会受到Ig G的影响,依然具有良好的抗肿瘤效果;2.通过ELISA实验发现IHP和IHPP对HER2具有相似的抗原亲和力。免疫荧光检测发现双特异性免疫毒素可以同时靶向肿瘤组织的HER2和PDGFRβ;3.通过计算Ki67阳性比例和测量肿瘤体积大小发现双特异性免疫毒素IHPP的抗肿瘤效果明显优于对照组的单靶向免疫毒素IHP和IPP;4.本研究采用高通量转录组测序技术对免疫毒素治疗后的NCI-N87移植瘤裸鼠肿瘤组织进行测序,探究IHPP和IHP产生不同治疗效果的原因。以小鼠基因组为基础比较IHPP和IHP治疗后的差异表达基因。转录组结果表明,IHPP可能是通过干扰素信号通路发挥了较强的抗肿瘤作用;5.实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测了转录组测序结果中的差异基因表达情况,同时ELISA检测了小鼠血液中干扰素α（Interferon-α,IFN-α）和干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）的含量,结果发现IHPP治疗后小鼠血液中的IFN-α和IFN-γ含量显著提高。结论1.成功构建了能同时靶向识别HER2和PDGFRβ的双特异性免疫毒素IHPP;2.双特异性免疫毒素在体内外显示出了良好的抗肿瘤效果;3.IHPP可能是通过干扰素信号通路发挥了较强的抗肿瘤作用。第二部分具有低免疫原性和脱靶毒性的免疫毒素IHP25-BT对曲妥珠耐药肿瘤细胞的治疗效果研究目的1.筛选曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR和BT474-TR;2.评估新型免疫毒素在体外对曲妥珠耐药肿瘤细胞的抑瘤效果;3.评估新型免疫毒素在体内对NCI-N87-TR异种移植瘤裸鼠模型的抑瘤效果。方法1.长期培养并筛选曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR和BT474-TR;2.通过蛋白质结构优化和氨基酸点突变改造构建新型免疫毒素IHP25-B、IHP25-T和IHP25-BT。通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U）和流式检测这些新型免疫毒素对曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR和BT474-TR的体外抑瘤效果。通过ELISA检测这些免疫毒素在小鼠体内的免疫原性并测量小鼠血清中谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）的含量来评估免疫毒素的脱靶毒性;3.建立NCI-N87-TR裸鼠移植瘤模型并通过Ki67免疫组化和肿瘤体积评估新型免疫毒素IHP25-BT的体内抑瘤效果。抗肿瘤治疗后通过苏木精-伊红（Hematoxylineosin,H＆E）染色和转录组测序分析IHP25-BT抑制肿瘤转移的潜在作用机制。结果1.本研究通过长期培养并筛选获得了曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR和BT474-TR,体外检测发现曲妥珠耐药细胞的增殖速率较野生型细胞有所提高,同时免疫印迹法（Western blot,WB）结果显示耐药细胞BT474-TR表面的HER2表达量显著增加;2.体外Ed U检测了免疫毒素IHP25-BT对NCI-N87和BT474野生型和曲妥珠耐药细胞的增殖抑制作用,结果发现新型免疫毒素IHP25-BT能够有效抑制曲妥珠耐药细胞的增殖。流式结果表明,免疫毒素IHP25-BT能够促进曲妥珠耐药肿瘤细胞的凋亡,与野生型细胞相比,曲妥珠耐药肿瘤细胞对免疫毒素的杀伤效果更加敏感;3.相较野生型NCI-N87,IHP25-BT能更好抑制曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR在小鼠体内的生长。小鼠肝脏H＆E染色结果表明,与曲妥珠相比,IHP25-BT能够降低曲妥珠耐药肿瘤细胞的远端转移。采用转录组测序技术对免疫毒素治疗后的NCI-N87-TR移植瘤裸鼠肿瘤组织进行测序,初步推测免疫毒素IHP25-BT可能是通过抑制细胞的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过程从而降低肿瘤细胞远端转移的潜在作用机制。结论1.成功筛选了曲妥珠耐药肿瘤细胞NCI-N87-TR和BT474-TR;2.新型免疫毒素在体内外对曲妥珠耐药肿瘤细胞显示出了良好的抗肿瘤效果;3.初步推测免疫毒素IHP25-BT可能是通过抑制细胞的ECM过程从而降低肿瘤细胞远端转移。