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小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病是世界范围内普遍发生、对经济影响最严重的小麦病害之一。开展小麦叶锈菌致病机制研究,对防治叶锈病,保障小麦安全生产具有重要意义。利用小麦抗叶锈近等基因系TcLr19及其感病突变体M433-3-11-2开展小麦与病原菌互作研究,对于揭示小麦叶锈菌致病机理具有重要意义。因此,本试验将叶锈菌株THTT的休眠夏孢子(BZ)、萌发芽管(MF)、THTT与TcLr19(R)和M433-3-11-2(M)互作早期(分别表注为RIQ和MIQ)和互作后期(分别标注为MI6d和RI6d)转录组进行RNA-seq测序。通过基因数字表达谱,分析基因表达水平,并在七大数据库(Nr,Nt,Pfam,KOG,Swiss-prot,KEGG,GO)进行功能注释。对差异表达基因,通过生物信息学分析来预测叶锈菌候选分泌蛋白,结合基因表达模式和功能,筛选出可能与致病相关的基因,为研究叶锈菌致病机制奠定基础。本试验主要结果如下: 1.小麦叶锈菌THTT通过Illumina HiSeqTM2000平台测序,叶锈菌休眠夏孢子、萌发夏孢子及与寄主互作的测序深度分别为8G、8G和12G。数字表达谱分析发现THTT在亲和互作和非亲和互作中差异表达丰富。在MF、MIQ和MI6d与BZ相比较,共同上调的基因100个,共同下调基因286个。MIQ与RIQ相比较,显著上调表达基因313个,下调表达基因3301个;MI6d与RI6d相比较,显著上调表达基因20928个,显著下调表达基因3159个。MI6d与MIQ相比较,显著上调表达基因17820个,下调表达基因2179个;RI6d与RIQ相比较,上调基因517个,下调表达基因5032个。在MIQ、RIQ和MI6d、RI6d共同上调表达基因151,共同下调表达基因2290个;MI6d、MIQ和RI6d、RIQ共同上调表达基因1个(Cluster-19789.81726),共同下调表达基因一个(Cluster-19789.97185)。 2.对差异表达基因进行GO功能富集,发现MIQ与RIQ相比较,差异基因主要富集在通道抑制子、萜类物质合成及纤维糖代谢和纤维糖氧化上,此外,涉及到大量的胞外区物质。MI6d与RI6d相比较,差异基因涉及生物学过程和细胞组分两大功能,包括细胞器、细胞代谢、氮素代谢、碱基复合物代谢以及分子功能中的核酸结合和阳离子结合。MI6d与MIQ相比较,差异基因主要富集在代谢过程、氮素代谢过程以及分子功能中的氧化还原活性、核酸结合和水解酶活性上。RI6d与RIQ相比较,差异基因主要富集在代谢过程、氮复合体代谢过程、氧化还原过程、胞外区和通道抑制子。 3.根据差异表达基因KEGG富集程度和基因功能,筛选出可能与致病相关的20个代谢通路。包括39个GPI相关基因,23个囊泡运输相关基因,140个糖酵解相关基因,113个ABC转运子基因等可能在叶锈菌中有重要作用。同时推测3个氨酸代谢基因(Cluster-19789.97938、Cluster-19789.101960、Cluster-19789.101958),4个果糖和甘露糖代谢相关基因(Cluster-19789.101603、Cluster-19789.97958、Cluster-19789.97685、Cluster-19789.93451),10个内吞作用基因可能为叶锈菌致病相关基因。 4.利用Signal P4.1、TMHMM2.0、Target P和Effector P对差异表达基因编码氨基酸序列进行效应蛋白预测,结果获得336个候选分泌效应蛋白。基因表达模式分析发现,这336个候选分泌蛋白分为三种类型,第一类,只在M433-3-11-2中表达,此类基因有109个。这些基因主要参与泛素介导的蛋白水解代谢、信号转导和泛素化生物过程;第二类,只在TcLr19上表达基因45个,主要参与蛋白质水解过程、离子通道抑制活性和核膜定位作用;第三类,在抗病寄主和感病寄主上均有表达的,共有182个基因。对Pfam结构域进行分析发现,效应蛋白多样性丰富,保守结构较少。 5.8个基因的定量分析结果与基因数字表达谱分析结果一致。表达模式有两种:Cluster-19789.73893、Cluster-19789.65598和Cluster-32222.0从BZ到THTT和寄主互作144h,基因上调表达;Cluster-19789.105186、Cluster-19789.110192、Cluster-19789.74609、Cluster-19789.68236和Cluster-19789.81277在192h前出现一个表达高峰后,其表达量出现了下调趋势。 综上所述,同一小麦叶锈菌与抗感不同的寄主互作,表现出复杂的作用机制。