第一部分体外培养CD-1胎鼠神经干细胞的鉴定及瘦素对神经干细胞增殖的影响　　目的：建立体外培养 CD-1胎鼠神经干细胞的培养方法,并观察瘦素对体外培养CD-1胎鼠神经干细胞增殖的作用。方法：神经干细胞来源自孕14天CD-1胎鼠海马, DMEM/F12+2％B27添加物+1%N2添加物+20ng/mlEGF+20ng/ml bFGF,含青霉素200IU/L和链霉素100IU/L构成神经干细胞完全培养基。用免疫细胞化学方法鉴定神经上皮巢蛋白( nestin)表达。利用5-溴-2’-脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)掺入DNA的特性,检测神经干细胞的增殖特性。采用配方为DMEM/F12+2%B27添加物+1%N2添加物+1%胎牛血清,含青霉素200IU/L和链霉素100IU/L的促分化培养基,诱导神经干细胞分化。检测分化细胞的β-tublin或GFAP的免疫细胞化学染色情况,以了解分化特性。将第二代神经干细胞分散后种植于96孔板(n=8),按照如下分组:空白对照组即为0ng/ml组(细胞培养基中加入0ng/ml瘦素);瘦素处理组Ⅰ(细胞培养基的瘦素终浓度为10ng/ml);瘦素处理组Ⅱ(细胞培养基的瘦素终浓度为20ng/ml);瘦素处理组Ⅲ(细胞培养基的瘦素终浓度为40ng/ml);瘦素处理组Ⅳ(细胞培养基的瘦素终浓度为80ng/ml);瘦素处理组Ⅴ(细胞培养基的瘦素终浓度为160ng/ml);48小时添加瘦素一次,共计添加瘦素3次,培养6天后,采用MTT法和CCK-8法观察瘦素对神经干细胞增殖的影响。结果：从孕14天CD-1胎鼠海马获得的细胞接种于神经干细胞完全培养基后,可以持续增殖并形成神经球。传代的细胞可表达Nestin蛋白,也可检测到Brdu的掺入后表达。将神经干细胞用促分化培养基培养后,神经干细胞可被诱导分化,其产生的细胞可表达β-tublin或GFAP。MTT法和CCK-8法均提示,与对照组相比,10、20、40、80、160ng/ml的瘦素可表现出较明显的剂量依赖性促进神经干细胞增殖效应,而且40ng/ml即具有理想增殖效果,80、160ng/ml的增值作用与之比较无统计学意义。结论：本研究培养的细胞具有神经干细胞的自我增值和分化潜能特性。瘦素可呈剂量依赖性促进体外培养的神经干细胞增殖,而且40ng/ml即具有理想增殖效果。　　第二部分瘦素促进体外培养CD-1胎鼠神经干细胞增殖作用中信号通路的研究　　目的：探讨JAK-STAT通路、cAMP/PKA/CREB通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路在瘦素促进体外培养CD-1胎鼠神经干细胞增殖中的作用。方法：神经干细胞的培养方法同前述。1. JAK-STAT通路的阻断剂AG490对瘦素促CD-1胎鼠神经干细胞增殖的影响:将第二代神经干细胞分散后种植于PLL包被的96孔板,24小时后分组处理(每组8孔):对照组(神经干细胞完全培养基不添加任何药物)、AG490溶剂对照组、AG490组(神经干细胞完全培养基中加入AG490,终浓度为10mM)、瘦素处理组(神经干细胞完全培养基中加入瘦素,其终浓度为40ng/ml)、瘦素与AG490共同处理组(神经干细胞完全培养基中同时加入40ng/ml瘦素和10mM的AG490)。2. cAMP/PKA/CREB通路的阻断剂H89对瘦素促CD-1胎鼠神经干细胞增殖的影响。分组同AG490组(每组8孔)。对照组(神经干细胞完全培养基不添加任何药物)、H89溶剂对照组、H89组(神经干细胞完全培养基中加入H89,终浓度为10mM)、瘦素处理组(神经干细胞完全培养基中加入瘦素,其终浓度为40ng/ml)、瘦素与H89共同处理组(神经干细胞完全培养基中同时加入40ng/ml瘦素和10mM的H89)。3. Ras/Raf/MEK/ERK/CREB通路的阻断剂PD98059对瘦素促CD-1胎鼠神经干细胞增殖的影响,分组同AG490组(每组8孔)。对照组(神经干细胞培养基不添加药物)、PD98059溶剂对照组、PD98059组(神经干细胞完全培养基中加入PD98059,终浓度为10mM)、瘦素处理组(神经干细胞完全培养基中加入瘦素,其终浓度为40ng/ml)、瘦素与PD98059共同处理组(神经干细胞完全培养基中同时加入40ng/ml瘦素和10mM的PD98059)。以上3个阻断实验中,48小时添加瘦素一次,共计添加瘦素3次,培养至第6天用CCK-8试剂盒检测神经干细胞的增殖情况。结果：CCK-8结果提示,与瘦素处理组相比,10mM的AG490处理体外培养的神经干细胞后,瘦素的促增殖能力明显下降(P<0.001);10mM的H89处理体外培养的神经干细胞后,瘦素的促增殖能力明显下降(P<0.001);10mM的PD98059处理体外培养的神经干细胞后,瘦素的促增殖能力明显下降(P<0.001)。结论：瘦素促体外培养神经干细胞的增殖作用与JAK-STAT通路、cAMP/PKA/CREB通路和Ras/Raf/MEK/ERK/CREB通路有关,瘦素的促增殖作用可被3个通路的阻断剂拮抗。　　第三部分瘦素对皮质酮抑制体外培养CD-1胎鼠海马神经干细胞增殖的影响及相关机制研究　　目的：研究瘦素对皮质酮抑制体外培养 CD-1胎鼠海马神经干细胞增殖的影响,以及NMDA受体在其中的作用。方法：1. CCK-8法观察瘦素对皮质酮抑制体外培养CD-1胎鼠海马神经干细胞增殖的影响。将第二代神经干细胞接种于96孔板(每组6孔),各组中DMSO终浓度均为0.1%。分组如下:对照组(Vehicle),神经干细胞培养基中不添加任何药物。皮质酮组(cort),神经干细胞培养基中添加皮质酮,终浓度为10mM。瘦素与皮质酮合用组(leptin+cort),细胞培养基中同时加入瘦素和皮质酮,终浓度分别为40ng/ml和10mM。MK-801阻断组,神经干细胞培养基中同时加入瘦素、皮质酮、MK-801,前两者终浓度分别为40ng/ml和10mM,MK-801参照文献设定3个浓度(1、3、10mM)。培养至第72小时用CCK-8试剂盒检测神经干细胞的增殖情况。2. ELISA方法观察瘦素及皮质酮处理后24小时培养海马神经干细胞膜NMDA2B受体表达的影响。将第二代神经干细胞接种于96孔板(每组6孔),各组中DMSO终浓度均为0.1%。分组如下:对照组(Vehicle),神经干细胞培养基中不添加任何药物。皮质酮组(cort),神经干细胞培养基中添加皮质酮,终浓度为10mM。瘦素组(leptin),神经干细胞培养基中添加瘦素,终浓度为40ng/ml。瘦素与皮质酮合用组(leptin+cort),细胞培养基中同时加入瘦素和皮质酮,终浓度分别为40ng/ml和10mM。24小时后,用ELISA方法观察神经干细胞膜表面NMDA2B受体的表达改变。3. Western blot检测瘦素及皮质酮处理后24小时培养海马神经干细胞膜NMDA2B受体表达的影响。将第二代神经干细胞接种于0.1%多聚赖氨酸包被的35mm培养皿中，每组3个培养皿,共4组,各组中DMSO终浓度均为0.1%,按照如下情况分组:对照组(Vehicle),神经干细胞培养基中不添加任何药物。皮质酮组(cort),神经干细胞培养基中添加皮质酮,终浓度为10mM。瘦素组(leptin),神经干细胞培养基中添加瘦素,终浓度为40ng/ml。瘦素与皮质酮合用组(leptin+cort),细胞培养基中同时加入瘦素和皮质酮,终浓度分别为40ng/ml和10mM。培养至第24h后进行Western blot实验。结果：1.10mM皮质酮组吸光度值低于对照组(P<0.001)。与皮质酮组相比,瘦素与皮质酮合用组(leptin+cort)的吸光度值上升(P<0.001)。10mM皮质酮、10mM的MK-801与40ng/ml瘦素共同处理组的吸光度值显著低于瘦素与皮质酮合用组(P<0.01)。2.细胞ELISA检测表明,与对照组相比,10mM皮质酮可显著抑制NMDA2B受体的表达(P<0.001),瘦素与皮质酮共同处理后可逆转这种结果。3. Western blot结果提示,与正常对照组相比,瘦素处理组可增加NMDAR2B受体表达约12.4%(P<0.01),而皮质酮降低NMDAR2B受体表达约22.3%(P<0.01)。结论：40ng/ml的瘦素可改善皮质酮导致的体外培养神经干细胞增殖的抑制作用。瘦素促进增殖及逆转皮质酮抑制增殖作用可能与细胞膜NMDA2B受体的表达上调相关。