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目的:Wnt家族成员之一Wnt5a与其它家族成员一样,在个体发育中必不可少,近来研究发现它与肿瘤发生密切相关,但确切关系和作用机制不明,特别是它与白血病发生的关系和作用罕见报道。本研究观察了Wnt5a在髓细胞白血病病例和白血病细胞株中的表达情况,提示Wnt5a表达缺失可能与白血病发生有关。进而以外源性Wnt5a处理髓系白血病细胞株K562,观察其诱导K562细胞分化的作用。该研究为深入认识Wnt5a在白血病发生中的作用和机制打下了基础,并希望为白血病诊断提供新的肿瘤标志物和基因治疗靶点。方法:1.应用RT-PCR方法检测6例慢性髓细胞白血病患者和5例急性髓细胞白血病患者的骨髓或外周血标本,以及Jurkat、K562、HL-60等白血病细胞株中Wnt5a的表达。2.应用HEK293细胞扩增带有标记基因GFP的重组腺病毒AdWnt5a和对照AdGFP,并制备条件培养液:以AdWnt5a和AdGFP分别感染CHO细胞,16h后荧光显微镜下检测GFP表达,更换为低血清培养液继续培养,于48h后收集培养上清液,冷冻、干燥浓缩后,Western Blot鉴定Wnt5a蛋白的表达。3.分别以Wnt5a和GFP条件培养液连续培养K562细胞1～5d,并以台盼蓝染色进行活细胞计数和总细胞计数,绘制生长曲线并进行统计学分析。4.流式细胞仪分析Wnt5a条件培养液处理K562细胞1、3、5d时细胞周期的变化情况,并与对照组细胞进行比较。5.将Wnt5a、GFP条件培养液分别处理1～5d的K562细胞进行瑞姬氏染色,光镜下观察细胞形态的改变,并在透射电镜下观察细胞超微结构的变化。6.将Wnt5a和GFP条件培养液分别处理1～7d的K562细胞涂片固定,进行过氧化物酶（POX）、糖原（PAS）、α-醋酸萘酚（α-NAE）+氟化钠抑制试验的细胞化学染色,光镜下观察细胞阳性率并进行统计学分析。7.将Wnt5a和GFP条件培养液分别处理1～7d的K562细胞涂片固定,利用免疫细胞化学染色法检测单核细胞表面分化抗原CD13、CD68的表达,和粒细胞表面分化抗原CD14的表达,计算阳性率并进行统计学分析。结果:1.6例慢性髓细胞白血病病例均未表达Wnt5a,5例急性髓细胞白血病病例其中4例不表达或弱表达,仅1例高表达经查为完全缓解的病例。在K562、HL-60髓系白血病细胞株中Wnt5a也不表达,而Jurkat细胞有高表达,与文献报道一致,故以Jurkat作为实验中的阳性对照。2.用HEK293细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒AdWnt5a和AdGFP上清液。分别以AdWnt5a和AdGFP上清感染CHO细胞,以制备Wnt5a和GFP条件培养液,荧光显微镜下观察到二者有较强的荧光信号,且Wnt5a条件培养液经Western Blot检测出了Wnt5a蛋白的表达。3.Wnt5a处理组、GFP对照组及未处理组的K562细胞,生长曲线显示,Wnt5a明显抑制K562细胞的增殖,但台盼蓝染色结果显示未影响到细胞的存活率。4.Wnt5a条件培养液处理5d的K562细胞与对照组细胞比较,细胞周期的G2期增高了3.22倍,表明Wnt5a将细胞周期阻止在G2期。5.光镜下与对照相比,经Wnt5a条件培养液处理的K562细胞:细胞体积缩小,核浆比减小,核染色质浓缩,核仁减少或消失,有的核出现了凹陷,并且出现了个别具有典型单核细胞形态的细胞。超微结构的变化:细胞核内异染色质增多,核仁减少或变小,胞质增多,核浆比减小,细胞器明显增多。6.Wnt5a处理后,K562细胞POX、PAS细胞化学染色的阳性率均明显提高,且与对照组相比差异显著。α-NAE染色呈强阳性,并且70%以上的阳性率可被氟化钠所抑制。7.Wnt5a处理组的K562细胞,其单核细胞系表面分化抗原CD14、CD68阳性率明显高于GFP对照组,二者差异显著;粒细胞系表面分化抗原CD13表达也增强,但与对照组比较无统计学意义。结论:1.RT-PCR方法检测发现,Wnt5a在90%的急、慢性髓细胞白血病和髓系白血病细胞株K562、HL-60中均表达缺失,而在1例完全缓解的病例中有表达,提示Wnt5a表达缺失可能与白血病的发生有关。2.Wnt5a条件培养液处理的K562细胞,与对照组相比:细胞生长明显受到抑制,细胞周期G2期明显增高,提示Wnt5a可能将K562细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖。3.Wnt5a条件培养液处理后细胞形态上出现了分化的表型,并观察到了个别典型的单核细胞形态,超微结构也显示有成熟的趋势。POX、PAS、α-醋酸萘酚（α-NAE）+氟化钠抑制的细胞化学染色结果表明,Wnt5a处理的K562细胞有向粒-单系统分化的现象。检测单核细胞系表面标志抗原CD14、CD68的免疫细胞化学染色结果,则进一步证实了外源性的Wnt5a可诱导K562细胞向单核细胞系分化的趋势。以上研究提示,Wnt5a表达缺失可能是髓细胞白血病发生的原因之一,Wnt5a可能在其中起到了抑癌基因的作用,该研究结果为白血病的基因诊断和治疗研究奠定了基础。