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目的通过对脑胶质瘤U87细胞培养以及实验性脑胶质瘤大鼠模型研究,探讨脑胶质瘤细胞U87中Hsa-miRNA-9-5p对MACC1的靶向调节作用,并在人脑胶质细胞瘤U87细胞系中进行了初步实验性研究。方法1、MACC1荧光素酶载体构建:根据GeneBank上公布的序列,分别对MACC13’UTR以及Hsa-miRNA-9-5p核心作用区突变序列设计引物,引物两端同时包含SpeI,MIU-1酶切位点与保护性碱基,使其PCR产物能够与表达荧光素酶的pMIR-REPORT质粒连接。2、双荧光素酶报告系统验证:接种1×105个HEK-293T细胞至96孔细胞培养平板中,按质粒DNA0.2μg与TransLipid 0.5μl分别稀释至25μl的DMEM培养基中,室温静置5min,将两者混匀,形成DNA-TransLipid复合物,然后加入到接种好的细胞中,前后摇动培养板,使复合物均匀分散。37℃,5%CO2培养,4-6h,更换培养基,继续培养48h。48h后将平板自培养箱中取出,按双荧光素酶报告系统检测试剂盒说明书试验方法,检测细胞发光量。3、MACC1 mRNA的表达检测:U87细胞接种后生长至90%,细胞状态最佳时将预先制备的慢病毒转染U87细胞。定期更换新鲜培养基,直至转染后第3天,收获所培养细胞,PBS洗两次,提取细胞总RNA,第一链cDNA合成按试剂盒说明书反转录成cDNA模板。Real-time PCR检测DC-LAMP表达水平。4、Sprague-Dawley:（SD）大鼠90只,随机分为5组。胶质瘤组（A组:18只）、生理盐水组（假手术组B组:18只）、正常对照组（C组:18只）、空载体组（D组:18只）、载体转染病毒（Hsa-miRNA-9-5p）组（E组:18只）。胶质瘤组和转染病毒组建立大鼠U87胶质瘤动物模型,生理盐水组颅内注射10μl生理盐水,正常对照组为正常大鼠。载体转染病毒组在接种U87胶质瘤细胞后第4和11天,于肿瘤原位注射转染病毒Hsa-miRNA-9-5p转染液,空载体组在接种U87胶质瘤细胞后的第4和第11天注入未转染空载体。五组均于接种U87胶质瘤细胞后第9天、15天和21天,在相应的时间点给大鼠行头颅磁共振检查,必要时行增强扫描。无痛处死大鼠后,显微镜下完整取出脑及脑胶质瘤组织,测量U87细胞胶质瘤的直径以及胶质瘤组织血管数量、面积、以及分子生物学试验,RT-PCR、western-blot等检测,统计分析检测结果,进一步探讨转染载体对MACC1因子的表达情况的作用。结果1、以cDNA为模板,含Hsa-miRNA-9-5p与MACC1相互作用的核心位点序列经PCR扩增后,经2%琼脂糖凝胶电泳,可见清晰目的条带。重组质粒经SpeI,MIU-1双酶切验证,大小正常,提示载体构建成功。2、将建好的干扰载体和携带荧光素酶的载体共同转染至HEK-293T细胞中,同时设立未转染干扰载体组,以及核心作用位点突变组作为对照,所有组以能够表达荧光的PRL-TK质粒作为内参。结果显示:MACC1 3’UTR突变组（Mut）绿色荧光蛋白表达量相比于对照组无明显变化。MACC1 3’UTR（Wt）绿色荧光蛋白表达量相比于对照组显著降低（P<0.05）,有统计学意义。3、将携带有Hsa-miRNA-9-5p的慢病毒颗粒转染至U87细胞,72h收获细胞,提取总RNA,检测mRNA的表达情况。Real-time PCR的结果显示:相比于正常对照组,经慢病毒转染的MACC1 mRNA表达显著降低（P<0.05）,有统计学意义。4、生理盐水组、正常对照组未见肿瘤生长。U87细胞转染成功后第9天,胶质瘤组和Hsa-miRNA-9-5p组肿瘤体积无明显差异（P>0.05）。然而,从转染成功后第15天至实验结束,胶质瘤组的肿瘤体积生长迅速,而Hsa-miRNA-9-5p组肿瘤体积的生长速度则明显减缓,与其他三组比较差异明显,有统计学意义（P<0.01）。5、转染组（血管面积密度0.55±0.22）可见血管分布稀疏,胶质瘤组（血管面积密度2.76±0.11）血管数量明显增多,差异有统计学意义。生理盐水组（血管面积密度1.43±0.21）、空载体组（血管面积密度1.41±0.11）,正常组（血管面积密度1.39±0.18）与转染组比较,血管分布稍多,差异无统计学意义。由于胶质瘤的生长,也是从微血管的生长开始的,所以检测血管的数量,也能反映胶质瘤的生长,抑制血管生成,也是一个很重要的治疗方向。观察血管密度情况,能反映病毒载体干预的作用及抗血管的治疗作用。6、Hsa-miRNA-9-5p重组腺病毒转染注入U87胶质瘤细胞后第9天、第15天、第21天,转染组肿瘤生长逐渐缓慢,与空载体组及对照组相比,有统计学意义,P=0.009（P<0.01）,MACC1表达明显减少,抑制作用明显,随着治疗时间的延长,抑制肿瘤生长速度更为明显,组间比较也更为明显,MACC1蛋白的表达量进一步下降。7、转染注入U87细胞胶质瘤后第9天、第15天、第21天,转染组MACC1mRNA的表达量明显减少,与空载体组以及对照组相比,有统计学意义,P=0.021（P<0.05）,MACC1表达明显减少,抑制作用明显,随着治疗时间的延长,抑制肿瘤生长速度更为明显,组间比较也更为明显,mRNA的表达量进一步下降,变化趋势与蛋白表达一致。结论1、MACC1是HGF/c-Met通路中一个重要的转移相关基因,在促进肿瘤细胞的化学趋向性、侵袭及迁移功能方面发挥关键的调节作用。2、人脑胶质细胞瘤中MACC1的表达与其恶性程度呈正相关,抑制MACC1的表达或许能抑制人脑胶质细胞瘤的恶性发展。3、Hsa-miRNA-9-5p可以靶向调控MACC1的表达,并在人脑胶质脑细胞瘤U87细胞系中进行了验证。4、U87细胞脑胶质瘤大鼠模型,肿瘤生长迅速,通过影像学以及新鲜脑胶质瘤组织得到证明。5、Hsa-miRNA-9-5p重组转染载体注入U87细胞后,可抑制MACC1基因的表达,从而抑制肿瘤的生长。6、Hsa-miRNA-9-5p可以靶向调节抑制MACC1的表达,是抑制胶质瘤发展的重要因子之一。