前言:白念珠菌是人体首位条件致病菌,广泛分布于皮肤粘膜表面。皮肤黏膜带菌或受到污染,并不一定致病,是否发病取决于念珠菌的毒力和宿主的免疫力,特别是宿主的免疫功能在发病过程中起决定性作用。研究发现白念珠菌可以“驯化”免疫系统,使免疫细胞具备更强的抗微生物防御能力。如白念珠菌预处理的巨噬细胞再次遭遇白念珠菌感染时,将触发较前次更强烈的炎症反应。以往的研究多关注白念珠菌与免疫细胞的直接作用,关注白念珠菌深部感染或系统感染时与宿主的相互作用。而皮肤作为人体最大的器官,也是重要的免疫器官,是白念珠菌进入深部的门户,其在白念珠菌感染防御中的作用当然至关重要。研究白念珠菌与皮肤及皮肤免疫系统的相互作用有重要的现实意义。位于皮肤最外层的是表皮,80%由角质形成细胞组成。角质形成细胞程序性地角化、脱落、更新,使得很多外源性病原菌未能及时侵入即随之脱落。与此同时,角质形成细胞将入侵信号通过博弈过程中分泌的细胞因子和降解产物,向附近的免疫细胞传递,募集专职的免疫细胞至损伤部位,引发炎症反应及免疫反应,共同抵御感染及损伤。天然免疫细胞是最早作出应答的细胞,而在皮肤免疫系统中,最为重要的天然免疫细胞是巨噬细胞,它们还兼为专职抗原提呈细胞,联系天然免疫反应与适应性免疫反应,对维持皮肤健康及免疫防御具有重要的作用。简言之,在皮肤屏障尚且完整时,外源性病原菌对话角质形成细胞、角质形成细胞又对话免疫细胞如巨噬细胞,后者作出应答,进一步产生保护或损伤。而白念珠菌作为皮肤黏膜的常驻菌,这种对话机制如确切存在且持续存在,其意义将更加不同寻常。迄今为止,鲜有相关文献报道。换言之,白念珠菌是否及如何通过细胞间对话机制,间接影响巨噬细胞的功能呢?发挥作用的介质可能是什么呢?本课题利用白念珠菌灭活孢子作用于角质形成细胞,制备条件培养基上清,体外模拟白念珠菌定植角质形成细胞后其所处微环境的变化,继而检测条件培养基上清对巨噬细胞趋化、吞噬、NO合成、MHCⅡ类分子和共刺激分子及PRR的表达,并对白念珠菌刺激角质形成细胞上清液进行“鸟枪法”蛋白质谱分析,筛选分泌型差异蛋白。基于实验结果,尝试回答上述科学问题。材料与方法:1、研究对象白念珠菌标准株ACTT 11006;人表皮角质形成细胞系HaCaT角质形成细胞株;人单核/巨噬细胞样细胞系U-937人单核细胞株。2、实验材料细胞培养及相关试剂;Real time RT-PCR相关试剂;Wetern-Blot相关试剂;NO检测试剂盒;Transwell检测相关试剂;免疫荧光检测相关试剂;流式细胞术相关试剂。3、实验方法(1)HaCaT角质形成细胞株、U-937人单核细胞株的培养;(2)白念珠菌标准株ACTT 11006的培养及灭活孢子的获得;(3)Transwell法检测巨噬细胞趋化功能;(4)流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能、巨噬细胞CD80、CD86、CD206、CD163、HLA-DR 的表达;(5)Griess法检测巨噬细胞NO合成;(6)Real time RT-PCR 法检测巨噬细胞 iNOS、CD86、HLA-D、TLR-2、TLR-4、dectin-IRmRNA 的表达;(7)Western-Blot法检测巨噬细胞TLR-2、TLR-4、dectin-1蛋白的表达;(8)Shot-gun蛋白质谱分析。4、统计学方法应用SPSS 20.0软件进行统计学处理,计量资料采用±SD表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,P<0.05有统计学意义。结果:1、体外白念珠菌刺激角质形成细胞后生成的条件培养基上清可增强巨噬细胞的趋化能力、吞噬功能,并使巨噬细胞遭遇白念珠菌时NO合成增多;2、白念珠菌刺激皮肤角质形成细胞生成的上清液可使巨噬细胞MHC Ⅱ类分子HLA-DR和共刺激分子CD86mRNA表达增高,但对蛋白水平表达无影响;3、白念珠菌刺激皮肤角质形成细胞生成的上清液对巨噬细胞极化无影响;4、白念珠菌刺激皮肤角质形成细胞生成的上清液可使巨噬细胞TLR-4表达增高,但不影响TLR-2及dectin-1的表达;5、“鸟枪法”蛋白质质谱分析,共鉴定肽段数3391个,蛋白质数719个,人工筛选分泌型差异蛋白11种,聚类分析前五位生物学功能为可变剪切、蛋白磷酸化修饰、蛋白结合、乙酰化修饰和小分子代谢。结论:1、白念珠菌灭活孢子可借助角质形成细胞间接增强巨噬细胞趋化、吞噬等非特异性功能;2、白念珠菌灭活孢子通过角质形成细胞增强巨噬细胞的部分免疫功能;3、白念珠菌灭活孢子刺激皮肤角质形成细胞上清液中有多种差异性分泌型蛋白表达,这些分泌蛋白中的某个或某组成分介导了角质形成细胞与巨噬细胞的相互作用。