背景:肝移植手术是终末期肝病患者的最有效治疗方法。肝移植术后5年生存率达到了约70%以上。但是肝脏移植手术过程中,受体不可避免经历了短暂的冷缺血再灌注期(ischemia/reperfusion;I/R);不但引起受体肝脏进一步损伤,而且会导致肝外多器官损伤,特别是肠道、肺脏和肾脏。这些器官损伤又是肝移植受体围术期临床预后不良的主要因素之一。肝脏冷缺血再灌注,可以引起肠道粘膜充血性缺血和再灌注损伤,肠道粘膜上皮细胞对于肠充血基础的缺血缺氧很敏感,这些细胞常常会在术后发生凋亡或坏死。本课题组临床预试验发现,肝移植围术期,患者发生了肠损伤和胃肠功能并发症。因此,本课题拟采用肝脏冷缺血再灌注模型,探讨程序性坏死(necroptosis)在肝移植围术期诱导肠粘膜损伤发生的机制,并进一步观察右美托咪定对肠粘膜屏障功能的保护机制。实验一:程序性坏死在肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤中的作用机制目的:程序性坏死是不同于细胞凋亡的细胞死亡方式。受体交互蛋白1(RIPK1)蛋白是细胞程序性坏死过程中重要的中间信号分子,RIPK1/RIPK3蛋白及其下游MLKL效应蛋白通过调控肠道上皮细胞和肠粘膜细胞代谢,调节细胞屏障功能和肠粘膜通透性。本实验拟观察程序性坏死信号通路在大鼠肝脏冷缺血再灌注后诱发肠损伤中的具体作用。方法:SPF级健康雄性成年SD大鼠48只,周龄10~12周,体重250~300 g,采用随机数字表法分为3组(n=16):假手术组(Sham Group)、模型组(I/R Group)、RIPK1阻断剂necrostatin-1组(NEC Group)。Sham组大鼠仅接受麻醉后开腹,游离肝脏周围的血管及韧带后关腹;I/R组大鼠采用肝脏冷缺血再灌注模型,使用4℃乳酸林格氏液持续灌注门静脉,30 min后随即恢复肝脏灌注,冲洗腹腔后关腹;NEC组大鼠造模前30min腹腔注射Nec-1 1mg/kg,手术操作同I/R组。于再灌注6 h和24 h,分别各选取大鼠8只,抽取肝下下腔静脉血样;分别获取部分肠组织样本进行测量;光学显微镜下观察肠组织病理学变化结果;采用ELISA法检测血清和肠组织TNF-α、IL-6、IL-10和HMGB1浓度及血清肠损伤标记物DAO、D-乳酸和I-FABP水平,测定血清内毒素(LPS)水平;采用硫代巴比妥酸法测定肠组织MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,过氧化氢法检测CAT活性,四甲基联苯胺法测定MPO活性;免疫组化法检测肠组织活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(active caspase-3)的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数;western blot法检测磷酸化的RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表达水平。结果:1、肠粘膜组织病理学变化:与sham组比较,I/R组和NEC组大鼠肠损伤后6 h和24 h的Chiu’s评分显著升高;W/D比率显著升高(P<0.05)。与I/R组比较,NEC组大鼠肠损伤后6 h和24 h的Chiu’s评分显著降低;W/D比率显著降低(P<0.05)。2、血清和肠组织细胞因子水平变化:与Sham组比较,I/R组和NEC组肠损伤后6h和24 h血清和肠组织TNF-α水平显著升高(P<0.05&<0.01);I/R组和NEC组肠损伤后6h和24 h血清和肠组织IL-6、IL-10及HMGB1水平显著升高(P<0.01);血清LPS水平显著升高(P<0.05)。与I/R组比较,NEC组肠损伤后6h和24h血清和肠组织TNF-α、IL-6水平显著降低,IL-10水平显著升高;血清LPS水平显著降低(P<0.05);NEC组肠损伤后6h和24h血清和肠组织HMGB1水平显著降低(P<0.05&<0.01);。3、肠组织损伤标志物水平变化:与肠损伤后6 h比较,肠损伤后24 h肠组织DAO、D-乳酸和I-FABP水平降低(P<0.05);与Sham组比较,I/R组和NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织DAO、D-乳酸和I-FABP水平显著升高(P<0.05);与I/R组比较,NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织DAO、D-乳酸和I-FABP水平显著升高(P<0.05)。4、肠组织氧化应激指标变化:与Sham组比较,I/R组和NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织MPO和MDA水平显著升高,肠组织SOD和CAT活性显著降低(P<0.01);与I/R组比较,NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织MPO和MDA水平显著降低,肠组织SOD和CAT活性显著升高(P<0.05)。5、肠组织细胞凋亡水平变化:与肠损伤后6 h比较,肠损伤后24 h肠组织激活caspase-3活性水平显著升高(P<0.05);与Sham组比较,I/R组和NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织激活caspase-3活性水平显著升高,凋亡细胞计数显著升高(P<0.05);与I/R组比较,NEC组肠损伤后6h和24 h肠组织激活caspase-3活性水平显著降低,凋亡细胞计数显著降低(P<0.05)。6、肠组织RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表达变化:与Sham组比较,I/R组和NEC组肠道组织RIPK1和RIPK3蛋白表达均上调(P<0.05);与I/R比较,NEC组肠道组织RIPK1和RIPK3蛋白表达下调(P<0.05)。结论:大鼠肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤机制是肠道炎症因子释放、氧化应激损伤和启动了程序性坏死。实验二:右美托咪定对肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤的影响及机制目的:观察右美托咪定对大鼠肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤的影响,并从炎症反应、氧化应激和细胞程序性坏死等方面阐述右美托咪定腹腔注射对肝脏诱发肠道损伤的保护作用。方法:成年雄性SD大鼠40只,周龄10~12周,体重250~300 g,采用随机数字表法分为5组(n=8):假手术组(Sham Group),进行单纯开关腹手术并且游离相应的血管;模型组(I/R Group),制备大鼠肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤模型;右美托咪定组(Dex Group),造模前30 min腹腔注射Dex 50μg/kg;Necrostatin-1组(Nec Group),造模前30min腹腔注射Nec-1 1mg/kg;右美托咪定+Necrostatin-1组(Dex+Nec Group),造模前30 min腹腔注射Dex 50μg/kg和Nec-11mg/kg。再灌注后6 h(sham组于术毕6 h),经肝下下腔静脉取血样;取部分肠组织样本进行测量;光学显微镜下观察肠组织病理学变化结果;采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-10和HMGB1浓度及肠损伤标记物DAO、D-乳酸和I-FABP水平,测定内毒素(LPS)水平;,采用硫代巴比妥酸法测定肠组织MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,过氧化氢法检测CAT活性,四甲基联苯胺法测定MPO活性;免疫组化法检测肠组织活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(active caspase-3)的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数;western blot法检测磷酸化的RIPK1和RIPK3蛋白表达水平。结果:与Sham组比较,I/R组、Dex组、NEC组和Dex+NEC组血清TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB1、LPS、DAO、D乳酸和I-FABP水平升高,肠组织MDA和MPO含量升高、SOD和CAT活性下降,Caspase-3蛋白表达水平、凋亡指数升高,肠组织病理学损伤加重,W/T比率升高,RIPK1和RIPK3蛋白表达上调(P<0.05&<0.01)。与I/R组比较;与I/R组比较,Dex组、NEC组和Dex+NEC组血清TNF-α、IL-6、HMGB1、LPS、DAO、D乳酸和I-FABP水平降低,血清IL-10水平升高;肠组织MDA和MPO含量降低、SOD和CAT活性升高,Caspase-3蛋白表达水平、凋亡指数降低,肠组织病理学损伤减轻,W/T比率降低,RIPK1和RIPK3蛋白表达下调(P<0.05&<0.01);与Dex组比较,NEC组和Dex+NEC组血清TNF-α、IL-6、HMGB1、LPS、DAO、D乳酸和I-FABP水平降低,血清IL-10水平升高;肠组织MDA和MPO含量降低、SOD和CAT活性升高,Caspase-3蛋白表达水平、凋亡指数降低,肠组织病理学损伤减轻,W/T比率降低,RIPK1和RIPK3蛋白表达下调(P<0.05)。结论:右美托咪定对大鼠肝脏冷缺血再灌注诱发肠损伤具有一定的保护作用,机制与其抗炎、抗氧化以及部分抑制RIPK1/RIPK3信号通路的激活有关。