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分化成熟的体细胞不经过中间的多能性状态而直接通过转分化转变成其他类型的体细胞或者成体干细胞的过程称作谱系重编程。在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast cells,MEFs)中表达肝脏器官发生中起重要作用的两个转录因子Hnf1β和Foxa3,将其诱导为肝干细胞(induced hepatic stem cells,i Hep SCs)的成功,是该研究领域的一项重要成果,然而其重编程过程中所涉及的分子机制却尚不清楚。四环素控制的诱导型表达载体是研究重编程进程的非常有用的工具。2008年,Brambrink和Stadtfeld就曾经利用这个体系揭示了MEF重编程为i PSCs细胞的时间进程,他们从整合了Oct4-GFP等位基因及四环素控制元件反式作用因子基因M2rt TA的小鼠中分离MEF细胞,该小鼠所携带的GFP报告基因可以显示内源性Oct4基因的激活情况,并表示细胞重编程的成功。借鉴体细胞重编程机制研究的经验,重编程的时间进程的确定可以说是研究细胞重编程过程中相关机制的研究基础之一,而构建高效可控的双因子慢病毒表达载体则是研究重编程进程的基础,所以四环素控制的Hnf1β和Foxa3表达载体的构建对本课题研究的开展十分重要。细胞重编程过程与胚胎发育和细胞分化过程有一个共同点是细胞都经历原有细胞表观标记的去除和新的细胞特异的表观修饰的建立,其中DNA甲基化与DNA去甲基化导致的细胞DNA甲基化模式的改变被认为是其中具有重要调控作用的机制。近年来多项研究证明Tet家族(Tet1、Tet2、Tet3)可以催化5-甲基胞嘧啶(5-m C)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hm C),从而实现DNA的主动去甲基化,而大量研究证明,Tet1在体细胞重编程中具有十分重要的作用。本课题着重于Tet家族成员在MEF细胞重编程为i Hep SCs中的作用开展了初步研究。我们首先构建了四环素诱导型的Hnf1β和Foxa3转录因子慢病毒表达载体,感染小鼠成纤维细胞后利用多西环素(doxycycline,Dox)来控制外源双因子的表达并观察细胞重编程的过程。我们利用这两个表达报告基因EGFP和m Cherry的表达载体成功获得了转分化的细胞克隆,通过鉴定发现诱导后的细胞在形态上与i Hep SCs相似,在转录水平上,表达胆管细胞的标志(CK19)、肝胆共同标志(CK18)以及一些肝脏干/前体细胞标志(Dlk1、Sox9、Ep CAM)。该结果证明我们初步建立了四环素控制的MEF细胞转分化为i Hep SCs的诱导体系。另外我们还发现,将获得的重编程细胞培养在撤掉Dox的i Hep SCs培养液中,细胞的干性特征在许多方面发生了变化,提示我们所获得的细胞中,外源基因的表达在其干性维持中起着非常重要的作用。该体系的建立为后续的研究奠定了基础。然后,我们利用q RT-PCR和免疫荧光染色方法证明了Tet家族成员在MEF重编程为i Hep SCs过程中的表达激活,同时也证明了其在i Hep SCs细胞中的表达维持,这些都提示了Tet家族的重要作用。与其表达相一致,细胞中5m C和5hm C的水平也发生了相应的变化。我们将利用Dox诱导表达系统对重编程过程中的细胞在不同的时间点进行取样,对这个过程中Tet表达水平及细胞甲基化和羟甲基化水平的变化规律做深入研究,并揭示该过程中转录组表达变化与甲基化水平变化之间的相关性。总之,本研究中我们建立了四环素诱导型的Hnf1β和Foxa3转录因子慢病毒表达载体并成功地建立了转分化的诱导体系,获得了由MEF细胞转分化而来的诱导型肝干细胞,并初步证明了Tet家族在重编程过程和干细胞干性维持中的重要作用,为后续研究打下了基础。