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第一部分内源性催产素及催产素受体参与慢性偏头痛的中枢敏化目的:慢性偏头痛（Chronic Migraine,CM）的病理生理机制不明。目前研究表明下丘脑可能参与CM的病理生理,而下丘脑分泌的催产素（Oxytocin,OT）参与疼痛的调控。内源性的OT及催产素受体（Oxytocin Receptor,OTR）是否参与CM的中枢敏化,目前还不清楚。本部分研究拟探讨内源性的OT及OTR在CM小鼠的下丘脑和三叉神经脊束核尾端（Trigeminal Nucleus Caudalis,TNC）的表达变化。方法:在建模的1、3、5、7、9天共5次腹腔注射硝酸甘油（Nitroglycerin,NTG）以建立CM小鼠模型。而后在药物注射前的1、3、5、7、9天及后面的11天用单纤维丝和热刺痛仪检测各组小鼠眶周、足底机械痛和足底热阈值的变化。通过免疫印迹法（Western Blot,WB）检测对照组和模型组TNC部分c-fos和（Calcitonin Gene-Related Peptide,CGRP）的蛋白表达变化以评估中枢敏化状态。然后采用WB、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）和免疫荧光比较对照组和模型组OT及OTR的表达变化。并通过双重免疫荧光法确定TNC部位OTR的亚细胞定位。结果:反复NTG刺激后小鼠的后足及眶周的机械痛和后足的热痛阈呈逐渐下降趋势,且在第11天没有NTG刺激时仍可见痛阈明显低于对照组（p＜0.05）。WB结果显示CM组小鼠TNC部位的c-fos及CGRP较对照组明显增高（p＜0.05）。免疫荧光分析显示NTG刺激后下丘脑OT阳性神经元和TNC的OT能神经纤维的表达均较对照组明显下降（p＜0.05）。另免疫荧光显示TNC部位可见OTR的表达,且主要位于神经元的细胞膜和突触后膜上。WB及PCR结果显示NTG刺激后OTR的表达较对照组明显升高（p＜0.05）。结论:NTG反复刺激可以建立稳定的CM动物模型并诱导中枢敏化。CM模型中存在内源性的OT/OTR功能障碍,提示体内的OT及OTR参与了CM的中枢敏化。第二部分OT对CM小鼠痛觉过敏及突触可塑性的影响目的:OT参与疼痛调控。既往研究显示CM中枢敏化后存在异常的突触可塑性。外源性的OT是否可以调控CM的中枢敏化,目前还没有报告。本部分研究拟探讨经鼻给予外源性OT对CM小鼠中枢敏化和突触可塑性的影响,并探讨OTR的作用。方法:通过NTG建立CM小鼠模型,并采用多次经鼻给予OT和腹腔注射OTR受体的拮抗剂L368,899预处理,将小鼠随机分为对照组（sham组）;NTG+溶剂（vehicle）组;NTG+OT组;NTG+OT+L368,899组。通过检测小鼠机械痛和热痛阈的变化及c-fos和CGRP的表达变化以评估OT的作用及OTR在其中的角色。通过WB检测NR2B（Nmethyl D-aspartate receptor subtype 2B subunit,NR2B）的磷酸化水平以评估（Nmethyl D-aspartate,NMDA）受体功能,及突触相关蛋白:突触后密度物95（Postsynaptic Density Protein 95,PSD-95）,突触囊泡融合蛋白1（Synaptophysin-1,syt-1）及突触体结合蛋白25（Synaptosomal-Associated Rotein25,snap-25）的表达变化。并应用透射电镜技术（Transmission Electron Microscope,TEM）和Golgi染色对CM小鼠TNC部位神经元的突触超微结构和树突棘密度变化进行观察分析。结果:多次经鼻给予OT（20μg/kg）可以改善NTG所诱导的机械痛敏和热痛敏,并降低TNC部位CGRP和c-fos的表达。而同时给予NTG+OT+L368,899组小鼠的痛觉过敏与NTG+OT组小鼠比较,仍存在痛觉过敏和中枢敏化（p＜0.05）。WB结果也提示OT治疗可以终止NTG刺激所引起的TNC部位NR2B的磷酸化及突触相关蛋白的表达增高。电镜结果和Golgi染色也显示OT治疗可以改善NTG刺激后TNC部位异常的突触可塑性及树突棘数目。L368,899可以终止上述OT的保护效应。结论:经鼻多次OT治疗可以通过TNC部位的OTR改善CM小鼠的痛觉过敏和中枢敏化,并通过抑制NR2B的磷酸化,影响NMDA受体功能,进而改善突触可塑性。重复鼻内OT治疗可能是预防CM的潜在治疗措施。第三部分AC1/PKA/p CREB通路参与OT调控CM的中枢敏化目的:目前研究显示腺苷酸环化酶1（Adenylyl cyclase 1,AC1）/蛋白激酶A（Protein Kinase A,PKA）/磷酸化的环磷腺苷效应元件结合蛋白（Phosphorylated c AMP Responsive Element-Binding Protein,p CREB）通路对于激活NMDA受体进而维持中枢敏化和突触可塑性有重要作用。而OT是否通过抑制AC1/PKA/p CREB通路调控CM的中枢敏化,目前还未见报道。本研究拟通过体内和体外实验两方面验证OT对AC1/PKA/p CREB通路的影响;方法:1、在CM动物模型的基础上,给予OT和L368,899干预后,通过WB检测各组TNC部位AC1、PKA、CREB、p CREB的蛋白表达情况;2、通过隔日腹腔注射NMDA受体的激动剂NMDA（0.5mg/kg和5mg/kg）模拟NTG的用药方式。并通过多次经鼻给予OT预处理,在药物注射前的1、3、5、7、9和11天分别检测各组小鼠后足机械痛阈和热痛阈的变化。并使用免疫荧光检测小鼠TNC部位c-fos的阳性细胞数的变化。通过WB评估各组TNC部位p NR2B,PKA、CGRP、p CREB的蛋白表达变化;3、体外培养PC12细胞,给予不同剂量的NMDA刺激后,通过MTT实验评估适合的干预剂量,为后续实验提供依据。后检测对照组和NMDA组神经元型氧化亚氮合酶（Neuronal Nitric Oxide Synthase,n NOS）和OTR的表达变化,评估细胞模型的可行性;4、根据实验目的,给予OT（10μM）干预后采用WB检测NR2B的磷酸化、n NOS、PKA和p CREB的蛋白表达情况;结果:反复NTG注射后可以引起TNC部位的AC1、PKA及p CREB的蛋白表达明显增加,而OT治疗可以抑制这三种蛋白的表达。反复NMDA刺激可以模拟NTG的作用引起小鼠的痛觉过敏,并刺激TNC部位c-fos阳性细胞数目增加,导致中枢敏化,同时促进NR2B的磷酸化蛋白、PKA和p CREB蛋白表达水平增高。而OT治疗可以起到改善痛觉过敏,抑制这些蛋白表达的作用。体外实验显示NMDA刺激可以促进PC12细胞的活化,引起n NOS和OTR表达增加。OT治疗可以通过抑制NR2B的磷酸化及n NOS、PKA和p CREB的蛋白表达影响PC12细胞的活化;结论:CM模型中存在AC1/PKA/p CREB通路的激活。OT可以通过抑制AC1/PKA/p CREB通路的激活,影响NMDA受体功能,起到改善痛觉过敏和中枢敏化的作用。