论文部分内容阅读
目的:蛋白质药物在癌症等多种疾病的治疗方面起着重要作用,然而由于蛋白质药物存在入胞效率低等问题,使其疗效和应用受到了限制。为了解决蛋白药物入胞难的问题,本课题构建了一种穿膜肽介导透膜的基质金属蛋白酶（MMPs）响应的蛋白质药物胞内递送系统,拟借助具有较强穿膜和携载能力的细胞穿膜肽（CPPs）来提高蛋白质药物的入胞效率,并引入对肿瘤相关蛋白酶MMPs具有特异性响应的蛋白酶酶切位点,对穿膜肽的功能进行选择性控制,弥补细胞穿膜肽无细胞选择性的缺点,优势互补,实现系统所携载的蛋白药物对肿瘤细胞的选择性、高效性入胞。内容:本论文完成了递药系统的构建及表征,并对递药系统的酶响应性和靶向性进行了体内外研究,进而对系统的安全性进行了评价。方法:1.递药系统的构建及表征。递药系统的蛋白部分利用E.coli原核表达体系融合表达,并通过亲和纯化获得。磁性纳米粒载体部分通过水热法制备得到,并采用XRD、EDX、TEM、DLS及测定磁滞回线等方法对其物相、形貌、分散性和磁化强度等进行表征。同时通过荧光测定、SDS-PAGE胶分离等方法对融合蛋白与纳米粒的结合能力、结合特异性进行了考察,并通过荧光滴定法考察纳米粒对荧光蛋白的淬灭效率,以确定系统的组装比例。2.递药系统的酶响应性及靶向性考察。1)酶水平:通过测定递药系统在人源重组MMP-2催化下所释放的荧光蛋白量,考察系统的酶响应性;2)细胞水平:通过细胞成像实验考察系统的酶响应性。3)体内:采用原位和静脉注射两种给药方式,考察荷瘤裸鼠肿瘤部位递药系统的分布,及在CPP携载下蛋白质药物mCherry入胞效果。3.递药系统安全性评价。通过细胞毒性实验验证递药系统的细胞毒性。并将构建系统按成像剂量于两周内对昆明鼠两次给药,观察此期间小鼠的体重变化,且给药两周后,对动物脏器系数和主要脏器病理切片进行系统的安全性分析。结果:1.递药系统的构建及表征。SDS-PAGE表明,融合蛋白的表观分子量约为32 kDa,与理论计算值一致,Western Blot结果确认了融合蛋白C端组氨酸标签的存在。XRD以及EDX谱图确定了NiFe2O4磁性纳米粒的晶型及元素组成。纳米粒的DLS分析表明其水合粒径约为131.2±0.9 nm,TEM显示其平均粒径约为80.3±3.0 nm,磁滞回线显示其饱和磁化强度为47.51 emu/g,可应用于递药系统的构建和磁靶向给药。融合蛋白与纳米粒结合能力、结合特异性考察实验证明了两部分结合的特异性。构建系统的水合粒径约为192.8±5.3 nm,平均粒径约为86.5±5.6 nm,有利于磁靶向和实现体内EPR效应。荧光淬灭效率实验结果表明,递药系统的最佳组装比例为融合蛋白:NiFe2O4磁性纳米粒为1.0:8.3（W/W）。2.递药系统的酶响应性及靶向性考察。体外酶响应性实验中,与对照系统相比,递药系统在重组人源MMP-2作用下,体系所产生的荧光随时间延长而增强,表明系统能有效被MMP-2所激活并释放出CPP-mCherry偶联物。细胞摄取实验中,高表达MMP-2的HT-1080细胞相比低表达MMP-2的MCF-7细胞显示出更强的红色荧光,表明所构建的递药系统能在肿瘤细胞表达的MMP-2作用下释放CPP-mCherry偶联物,使mCherry在CPP携载下跨膜入胞。体内动物实验中,实验组裸鼠肿瘤比对照组（MMP-2酶切位点突变组）荧光强度强,并且施加磁场组比无磁场组荧光强度更强,此结果表明,在磁场和EPR效应作用下,递药系统得以在肿瘤部位聚集,并在肿瘤部位高表达的MMP-2作用下,促使透膜性CPP去屏蔽并携载mCherry进入细胞。以上结果表明,所构建递药系统具有较好的酶响应性和体内靶向性。3.递药系统的安全性评价。细胞毒性实验显示,系统对于正常细胞无明显生长抑制,当给药浓度达200μg/mL时细胞存活率仍在70%以上。而小鼠毒性实验显示,与对照组相比,实验组昆明鼠的体重和脏器系数无明显差异。取主要脏器病理切片分析,结果显示,与PBS对照组相比,实验组主要脏器心、肝、脾、肺、肾均无明显病理变化,表明构建递药系统具较好生物相容性。结论:本课题构建了一个MMP-2响应的CPP介导透膜的蛋白质药物胞内靶向递送系统,并分别从酶水平、细胞水平及动物水平系统研究了该系统的酶响应性和靶向性。体内和体外的实验结果均显示,在MMP-2激活下,该系统能较好地实现蛋白质药物的肿瘤胞内靶向递送。此外,系统的生物相容性分析结果表明,该系统具有较好的生物相容性,具备临床应用的巨大潜力。