【摘 要】
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副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum,Apg）属于巴氏杆菌科、禽杆菌属,引起鸡的传染性鼻炎（infectious coryza,IC）,导致育成鸡生长不良、产蛋鸡产蛋量下降,造成严重的经济损失。目前常用的IC疫苗是全菌灭活疫苗,但此类疫苗由于含有脂多糖等细菌成分,接种后往往出现较严重的副反应。因此,对于减毒活疫苗等其它类型疫苗的研究显得十分迫切。本研究建立了一种Apg
【基金项目】
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财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系（CARS-40-K16）; 江苏高校优势学科建设工程资助项目
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副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum,Apg）属于巴氏杆菌科、禽杆菌属,引起鸡的传染性鼻炎（infectious coryza,IC）,导致育成鸡生长不良、产蛋鸡产蛋量下降,造成严重的经济损失。目前常用的IC疫苗是全菌灭活疫苗,但此类疫苗由于含有脂多糖等细菌成分,接种后往往出现较严重的副反应。因此,对于减毒活疫苗等其它类型疫苗的研究显得十分迫切。本研究建立了一种Apg的自然转化方法,并应用转座子技术获得了一株减毒A型Apg突变株,为进一步研发减毒活疫苗打下了基础。1.Apg自然转化方法的建立本研究参考流感嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌等其它巴氏杆菌科细菌关于自然转化的研究,通过对Apg的基因组进行分析,发现DNA短序列5’-ACCGCACTT-3’在Apg基因组中存在1537～1641个拷贝,预测该序列为Apg的摄取信号序列（Uptake signal sequence,USS）。在Apg的基因组中还鉴定出16个自然转化相关基因,分别与感受态基因的调控、DNA的摄取及其加工处理等过程密切相关;其中11个基因的上游启动子区域存在CRP-S位点,在Sxy的作用下,激活的cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein,CRP）结合在靶标基因启动子上的CRP-S位点,起始相关感受态调控基因的转录,促进细胞自然感受态的形成。表明Apg具有通过自然转化摄取外源基因的能力。本研究构建了穿梭质粒pEA-KU和pEA-K。利用M-Ⅳ培养基诱导Apg发生自然转化,成功将穿梭质粒导入Apg中,从而建立了一种应用于Apg的自然转化方法。通过进一步试验还发现,在Apg的自然转化过程中,携带USS的质粒更容易被菌体摄取;同时,不同Apg菌株间的自然转化能力也存在较大差异,在受测菌株中,2019/HB64的转化效率显著高于其他菌株。2.减毒株筛选与生物学特性研究本研究应用自然转化方法将转座子Tn5-kan导入Apg中,以2019/HB64为亲本构建了随机突变库。为了寻找适合的IC减毒活疫苗候选株,本研究首先筛选到一株生物被膜形成能力以及血凝能力显著降低的突变株2019/HB64-40。进一步研究发现,菌株2019/HB64-40的生长速度较慢,生长平台期较短,表明其生长性能降低。利用染色体步移技术测定鉴定到该突变株的转座子插入位点为rsmA基因。通过动物试验以评价菌株2019/HB64-40的致病性,将45只试验鸡分为3组（2019/HB64攻毒组、2019/HB64-40攻毒组、空白对照组）,28日龄时进行攻毒,通过临床症状评分、剖检病变和呼吸道排菌量进行评价。结果发现2019/HB64攻毒组的试验鸡3 d内全部发病,平均临床症状评分为2.06,表现为严重的颜面部肿胀,7 d剖检可见眶下窦有黄色干酪样物质及喉头出血等病变;2019/HB64-40攻毒组3d内仅部分试验鸡（4/15）发病,平均临床症状评分为0.40,发病鸡仅表现为面部轻微肿胀,剖检无病变。2019/HB64-40攻毒组的排菌量显著低于2019/HB64攻毒组。上述结果表明,突变株2019/HB64-40的毒力较菌株2019/HB64显著减弱。通过动物试验对减毒株2019/HB64-40的免疫保护效果进行评价,将30只试验鸡分为3组（免疫组、未免疫组、空白对照组）,使用减毒株2019/HB64-40作为免疫剂,在试验鸡28日龄时通过滴鼻方式进行免疫。结果发现,在接种后21 d可以在免疫组血清中检测到较高水平的血凝抑制抗体效价。在试验鸡49日龄时进行攻毒,未免疫组3 d内全部发病且症状严重,临床症状评分为2.5;而免疫组仅1/10出现轻微临床症状,且5 d时症状已经消退。攻毒后5 d起,免疫组的排菌量显著低于未免疫组,综合临床症状、剖检病变和排菌量等指标,减毒株2019/HB64-40具有良好的保护效果。综上,本研究应用转座子技术构建了 A型Apg的随机突变库,通过筛选得到了一株减毒株,其有作为减毒活疫苗候选株的可能性,为进一步开发Apg的减毒活疫苗提供了参考和基础。
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