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补体系统是固有免疫的重要组成部分,在无脊椎动物免疫防御过程中发挥了重要作用。尽管无脊椎动物中已经发现了补体分子类似物,但补体凝集素途径的分子组成和激活机制尚不清楚。本研究采用基因克隆、RT-PCR、免疫组化及原核重组表达等分子生物学技术,对长牡蛎的C型凝集素(CgCLec-2~-4)及甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin associated serine protease,MASP)类似分子(CgMASPL-1~-5)的结构和功能进行了研究,初步探讨长牡蛎中可能存在的补体系统凝集素途径。根据长牡蛎基因组序列信息,分别克隆获得了CgCLec-2、CgCLec-3和CgCLec-4基因,CgCLec-2和CgCLec-4含有典型的C型凝集素样结构域(C-type lectin-like domain,CTLD),其糖识别基序分别为EPN和EPA,而CgCLec-3缺乏完整的CTLD和典型的糖识别基序。CgCLec-2和CgCLec-3主要在外套膜或者鳃中表达,灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激可显著诱导这三个分子mRNA的表达水平上调。三种CgCLecs重组蛋白均具有广谱的PAMPs识别与结合活性,且rCgCLec-2具有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)凝集活性,rCgCLec-3和rCgCLec-4对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌表现出凝集活性。此外,3种rCgCLecs均可以显著促进牡蛎血淋巴细胞对灿烂弧菌的吞噬。rCgCLec-2可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长,rCgCLec-3可抑制大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生长,并对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的细胞结构有破坏作用。结果表明,CgCLec-2、CgCLec-3和CgCLec-4不仅作为模式识别受体参与免疫识别,并且可通过调理作用、抑制微生物生长或者破坏细胞结构等途径参与宿主对微生物的清除,在长牡蛎的免疫防御中发挥重要作用。从长牡蛎中克隆获得了五种CgMASPLs基因,发现CgMASPL-1~-5均含有丝氨酸蛋白酶结构域(serine protease domain,SPD),其H链各不相同且都缺乏高等动物同源分子保守的CCP结构域,提示低等无脊椎动物MASP分子的结构多样性及低保守性。以偶氮酪蛋白为底物检测它们的丝氨酸蛋白酶活性,发现缺乏典型S位点且以酶原形式参与检测的rCgMASPL-1和酶原形式的rCgMASP-2分子具有较低的丝氨酸蛋白酶活性,而其他分子的SPD结构均具有较高的丝氨酸蛋白酶活性。利用Pull-down技术研究了rCgCLec-2与rCgMASPLs分子间的相互作用,发现其可与含有CUB结构域的rCgMASPL-1及rCgMASP-2分子结合,形成类似高等动物collectin/MASP的复合物,提示长牡蛎中可能存在原始的补体系统凝集素途径。综上所述,长牡蛎CgCLecs作为长牡蛎固有免疫中重要的模式识别受体参与了对外源微生物的免疫识别和清除。CgCLecs和CgMASPLs在结构和功能上与高等动物补体系统中的甘露糖结合凝集素和MASP有一定相似性,且CgCLec-2可与CgMASPLs相互作用,提示长牡蛎中可能存在原始的补体系统凝集素途径。上述结果为进一步探讨长牡蛎补体系统的分子组成和凝集素介导的补体激活机制,揭示无脊椎动物补体系统的进化脉络奠定了基础。