【摘 要】
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从自然界中筛选获得一株高产壳聚糖酶的D-1菌株,经鉴定属于青霉属(Penicillium),是目前所见报道中唯一能够产两种壳聚糖酶的青霉.通过研究,确定了Penicillium sp.D-1产酶的最
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从自然界中筛选获得一株高产壳聚糖酶的D-1菌株,经鉴定属于青霉属(Penicillium),是目前所见报道中唯一能够产两种壳聚糖酶的青霉.通过研究,确定了Penicillium sp.D-1产酶的最适发酵条件:培养温度32℃,底物壳聚糖浓度2.5%,装量为500ml三角瓶装100ml培养基,培养基pH5.0.在上述培养条件下,第108h时摇瓶中发酵液的最高酶活力达4.696U/ml.Penicillium sp.D-1能产生诱导型的胞外壳聚糖酶.采用(NH4)2SO4盐析法和凝胶过滤层析对Penicillium sp.D-1的壳聚糖酶进行分离提纯,得到两种壳聚糖酶(酶A和酶B),酶A经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,结果显示该酶的分子量约为93 kD;酶B经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)和SDS-PAGE分析,得出分子量约为21 kD.两种壳聚糖酶最适反应pH值均为pH4.0,在pH 3.0-5.0的酸性环境中保持稳定.酶A和酶B的最适反应温度分别为52℃和48℃;酶A在52℃保温60min,酶活为80%,酶B在40℃以上易失活.酶A的活性能够被Mn<2+>激活,酶B的活性则能够被Ca<2+>激活,Cu<2+>,Fe<3+>和Ag<+>则对两种酶的活性都有抑制作用.酶A的米氏常数K<,m>及最大反应速度V<,max>分别为7.35mg/ml、0.206 μmol/min·mg,酶B的米氏常数K<,m>及最大反应速度V<,max>分别是30.42mg/ml、0.376μmol/min·mg.通过PCR反应扩增出一段长度为270bp的壳聚糖酶基因片段;与NCBI数据库中已知的真菌壳聚糖酶氨基酸序列进行序列比对,结果显示它们彼此之间的同源性比较高.
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